徐幸 楊芳 王燕平 謝家廉 李躍建 彭云良 姬紅麗

摘要 調(diào)查四川省成都平原地區(qū)水旱輪作田根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生情況及種類分布，為水旱輪作田根結(jié)線蟲(chóng)的防治提供依據(jù)。對(duì)成都平原15個(gè)縣（市、區(qū)）28個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）共159塊水旱輪作田的土樣進(jìn)行根結(jié)線蟲(chóng)普遍率調(diào)查，利用線蟲(chóng)ITS通用引物和8對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物對(duì)其中檢出率高的地區(qū)重新采集的土樣進(jìn)行根結(jié)線蟲(chóng)種類分子鑒定。結(jié)果表明，成都平原水旱輪作田根結(jié)線蟲(chóng)平均檢出率為40.25%。重新采集的土樣共鑒定出5種根結(jié)線蟲(chóng)：擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne graminicola、花生根結(jié)線蟲(chóng)M.arenaria、南方根結(jié)線蟲(chóng)M.incognita、北方根結(jié)線蟲(chóng)M.hapla和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)M.javanica，各線蟲(chóng)的檢出率分別為40.91%、34.09%、13.64%、13.64%和2.27%，其中2955%的樣品由2種以上根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染。擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)和花生根結(jié)線蟲(chóng)為該地區(qū)優(yōu)勢(shì)種群。

關(guān)鍵詞 普遍率; 特異性引物PCR; 擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng); 花生根結(jié)線蟲(chóng); 混合侵染

中圖分類號(hào)： S 432.45

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020294

Prevailing species of root-knot nematodes from paddy-upland rotation fields in Chengdu plain

XU Xing1， YANG Fang1， WANG Yanping1， XIE Jialian1， LI Yuejian2， PENG Yunliang1， JI Hongli1*

（1. MARA Key Laboratory of Integrated Management of Pests on Crops in Southwest China， Institute of Plant Protection，

Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China; 2. Institute of Horticulture Research， Sichuan

Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China）

Abstract

To investigate the prevailing species of root-knot nematodes （RKNs） from paddy-upland rotation fields in Chengdu plain of Sichuan province， 159 soil samples were taken from 28 townships in 15 counties （districts or cities）. The RKNs species were identified by universal primer pair for ITS region of RKNs and eight species of species-specific primers amplification from re-collected samples where high infestation incidence was found in the first round of sampling and bioassay. 40.25% of 159 samples were found to be able to cause root knots in the root systems of either rice or tomato. Five species of RKNs， i.e.， Meloidogyne graminicola， M.arenaria， M.incognita， M.hapla and M.javanica were identified， with the infestation incidence of 40.91%， 34.09%， 1364%， 13.64% and 2.27%， respectively. 2955% of the re-investigation samples were infested with two or more species of RKNs. M.graminicola and Marenaria were the dominant species in paddy-upland rotation fields in Chengdu plain.

Key words

infestation incidence; species-specific PCR; Meloidogyne graminicola; M.arenaria; mixed infestation

根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne spp.作為全球農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)危害最嚴(yán)重的植物病原線蟲(chóng)，其寄主和地理分布范圍廣泛[1]。根結(jié)線蟲(chóng)侵染植物根部后，根部細(xì)胞過(guò)度分裂、膨大，使根部形成根結(jié)，導(dǎo)致根系的吸收能力降低，被害株長(zhǎng)勢(shì)衰弱、甚至提早死亡。此外根結(jié)線蟲(chóng)侵染造成植物根系的損傷還利于土壤中植物寄生真菌的侵入和危害。目前世界上報(bào)道有98種根結(jié)線蟲(chóng)，其中有40余種在我國(guó)已有發(fā)生記載[2]。隨著種植結(jié)構(gòu)調(diào)整，根結(jié)線蟲(chóng)病在我國(guó)發(fā)生和危害日益加重，一般導(dǎo)致作物減產(chǎn)15%～25%，部分田塊損失高達(dá)70%以上，甚至絕收[2]。在根結(jié)線蟲(chóng)研究中，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中最常見(jiàn)、危害最重的有南方根結(jié)線蟲(chóng)M.incognita、花生根結(jié)線蟲(chóng)M.arenaria、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)M.javanica、北方根結(jié)線蟲(chóng)M.hapla[2]，以及近年來(lái)新發(fā)生并嚴(yán)重威脅水稻等作物生產(chǎn)的擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)M.graminicola[3]。擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在水稻、旱稻、直播稻、秧田和育秧工廠內(nèi)均可危害，受害水稻產(chǎn)量損失率最高可達(dá) 80%以上[1]。該線蟲(chóng)于2000年在我國(guó)海南三亞首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)已陸續(xù)在福建、湖北、湖南、浙江等地有發(fā)生報(bào)道[4-6]，本實(shí)驗(yàn)室也在四川水稻種植區(qū)發(fā)現(xiàn)其危害[7]。已有研究表明，多種根結(jié)線蟲(chóng)混合發(fā)生在我國(guó)南方是常見(jiàn)現(xiàn)象[8-9]。

水旱輪作是我國(guó)南方最主要的耕作形式之一，僅西南地區(qū)常年實(shí)行水旱輪作的稻田即超過(guò)250萬(wàn)hm2[10]，成都平原水旱輪作歷史悠久，是西南地區(qū)最重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)區(qū)。長(zhǎng)期以來(lái)，水旱輪作被認(rèn)為是控制根結(jié)線蟲(chóng)病危害的有效手段[11-12]，但近年來(lái)屢有根結(jié)線蟲(chóng)在稻田發(fā)生和危害的報(bào)道，因此有必要對(duì)成都平原水旱輪作田根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生普遍率以及發(fā)生種類進(jìn)行調(diào)查，為整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的健康管理提供依據(jù)。本研究對(duì)該區(qū)域水旱輪作田分布區(qū)的土壤進(jìn)行了抽樣，調(diào)查了根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生普遍率。采用通用引物和8種常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)的特異性引物擴(kuò)增的方法鑒定了根結(jié)線蟲(chóng)混合種群。明確了成都平原水旱輪作田根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生普遍程度和種類分布，以期進(jìn)一步明確其傳播、發(fā)生規(guī)律，制定科學(xué)合理的防控策略。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2017年12月-2018年2月在成都平原選擇15個(gè)區(qū)（縣、市）28個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）共159塊田（表1）采集土樣。自田一邊起沿“Z”字形路線取樣10點(diǎn)至田對(duì)邊，各點(diǎn)取樣深度約10～15 cm，每塊田土樣總重量在750～1 000 g之間，于室外遮陰保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品生物測(cè)定

將采集的各田塊土樣擂碎，加入營(yíng)養(yǎng)土和滅菌河沙（3∶1）后充分混勻，平均分成3份放入帶托盤(pán)（15 cm×15 cm）的花盆（14 cm×14 cm）中，每盆土壤表面一半播種20粒左右番茄（‘美國(guó)紅冠，四川省良明農(nóng)業(yè)科技有限公司）種子，另半邊播種20粒左右水稻（‘日本晴）種子，種子上面覆蓋一層滅菌細(xì)土后，用有效成分75%百菌清600倍稀釋液噴霧至表土充分濕潤(rùn)預(yù)防立枯病。28℃溫室中培養(yǎng)50 d后，拔取水稻和番茄根系洗去泥沙后，調(diào)查兩種植物根系有無(wú)根結(jié)形成，產(chǎn)生根結(jié)土樣記為陽(yáng)性+，無(wú)根結(jié)記為陰性-。檢出根結(jié)土樣數(shù)占總土樣數(shù)的百分比即為該地區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)普遍率。

1.3 根結(jié)線蟲(chóng)種類重檢測(cè)與鑒定

2018年8月和2019年3月分別在上述測(cè)定中土樣根結(jié)線蟲(chóng)檢出率較高的什邡、廣漢和綿陽(yáng)市安州區(qū)按照上述1.1方法重新采集44塊田土樣（表2），按1.2方法進(jìn)行根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生普遍率重復(fù)測(cè)定。

1.3.1 土樣線蟲(chóng)DNA提取

收集重復(fù)測(cè)定中檢出根結(jié)土樣的水稻和番茄根系后，清洗掉泥沙，用剪刀剪碎根系并剪破根結(jié)以淺盤(pán)分離法分離獲得2齡幼蟲(chóng)懸浮液。線蟲(chóng)懸浮液于4℃冰箱靜置過(guò)夜后，收集根結(jié)線蟲(chóng)于2 mL離心管中，再將離心管液氮速凍30 s后放在振動(dòng)磨樣機(jī)中磨樣30 s，參照崔汝強(qiáng)等的方法[13]提取線蟲(chóng)DNA。

1.3.2 根結(jié)線蟲(chóng)種類分子鑒定

根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)中線蟲(chóng)DNA通用引物和特異性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14-18]（引物序列見(jiàn)表3）。采用25 μL反應(yīng)體系： 2×Master MIX（北京擎科生物） 12.5 μL， 10 μmol/L

上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 3 min;94℃ 30 s，退火溫度（表3）30 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。其中不加模板DNA的滅菌ddH2O作為陰性對(duì)照，用收集的8種已知種類根結(jié)線蟲(chóng)DNA樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠110 V電泳 20 min進(jìn)行檢測(cè)，在紫外照膠儀上觀察并照相，剩余PCR產(chǎn)物送擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并將序列上傳至GenBank得到登錄序列號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 成都平原根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生普遍率

采集的159塊田土樣（表1）中，有64塊田土樣在所播種的水稻或番茄根系產(chǎn)生根結(jié)，根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生普遍率平均為40.25%，其中25.16%的土樣中種植的番茄感染根結(jié)線蟲(chóng)，17.61%的土樣中種植的水稻感染根結(jié)線蟲(chóng)，8.81%的土樣中兩種作物均感染根結(jié)線蟲(chóng)。

根據(jù)調(diào)查結(jié)果，我們選取土樣根結(jié)線蟲(chóng)檢出率高的3個(gè)地區(qū)，即在什邡市采集22塊田、廣漢市10塊田和綿陽(yáng)市安州區(qū)12塊田，共重新采集44塊田土樣并進(jìn)行土樣根結(jié)線蟲(chóng)檢測(cè)，其中共26塊田土樣能使水稻或番茄產(chǎn)生根結(jié)，根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生普遍率為59.09%，其中使番茄或水稻感染根結(jié)線蟲(chóng)的土樣各占54.55%。使兩種作物感染根結(jié)線蟲(chóng)的土樣占50%（表2）。

2.2 病原線蟲(chóng)分子生物學(xué)鑒定

利用線蟲(chóng)ITS通用引物RK28SF/MR對(duì)重新采集的26個(gè)檢出根結(jié)土樣中分離出的線蟲(chóng)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能得到約612 bp的唯一擴(kuò)增片段，與根結(jié)線蟲(chóng)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的PCR擴(kuò)增片段大小一致。隨后，用8種常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)的特異性引物對(duì)26個(gè)陽(yáng)性土樣的線蟲(chóng)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共得到5種大小不同的片段，其大小分別與標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度一致（圖1）。從5種擴(kuò)增片段中每種選擇1個(gè)進(jìn)行雙向測(cè)序，并進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，樣品YX8序列（登錄號(hào)：MT406773）與已知擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)M.graminicola（登錄號(hào)：MK559561.1）序列相似度99%以上，ZH1（登錄號(hào)：MT406772）與已知南方根結(jié)線蟲(chóng)M.incognita（登錄號(hào)：MK292132.1）序列相似性為100%，YX2（登錄號(hào)：MT408129）與已知花生根結(jié)線蟲(chóng)M.arenaria（登錄號(hào)：KP253748.1）序列相似度99%以上，XL3（登錄號(hào)：MT408130）與已知爪哇根結(jié)線蟲(chóng)M.javanica（登錄號(hào)：KF041313.1）序列相似度在91%以上，YX1（登錄號(hào)：MT408131）與已知北方根結(jié)線蟲(chóng)M.hapla（登錄號(hào)：GQ130137.1）序列相似度在99%以上。

44份新采集土樣中，共有26份含根結(jié)土樣，其中18份土樣中檢出擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)，在44份總樣品中的發(fā)生率為40.91%，檢出的其他幾種線蟲(chóng)發(fā)生率分別為：花生根結(jié)線蟲(chóng)（34.09%）、南方根結(jié)線蟲(chóng)（13.64%）、北方根結(jié)線蟲(chóng)（13.64%）以及爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（2.27%）。44份重測(cè)樣品中未檢出象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)M.enterolobii、奇特伍德根結(jié)線蟲(chóng)M.chitwoodi和偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(chóng)M.fallax（表4）。

44份樣品中29.55%的樣品僅檢測(cè)出1種根結(jié)線蟲(chóng)，其中擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)占13.64%，花生根結(jié)線蟲(chóng)占11.36%，北方根結(jié)線蟲(chóng)和南方根結(jié)線蟲(chóng)各占227%;29.55%的樣品由兩種以上根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，其中2種、3種、4種和5種根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染的土樣占重測(cè)樣品的比例分別為15.91%、11.36%、2.27%和0?；旌锨秩緲悠分凶畛Ｒ?jiàn)的為擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)和花生根結(jié)線蟲(chóng)兩種根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，占重測(cè)樣品的9.09%，擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)與南方根結(jié)線蟲(chóng)等3種根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，以及擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)與北方根結(jié)線等3種根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染的土壤樣品數(shù)均為2個(gè)，占重測(cè)樣品的4.55%，新采集樣品中有一份樣品是由擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)、南方根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)等4種線蟲(chóng)混合侵染，占2.27%。

3 結(jié)論與討論

成都平原是西南地區(qū)糧食和蔬菜等作物最重要的產(chǎn)區(qū)，也是全國(guó)重要農(nóng)區(qū)[10]。水旱輪作是成都平原最主要的耕作方式，但關(guān)于水旱輪作田根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生情況報(bào)道較少[7， 19-20]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)成都平原水旱輪作田已經(jīng)是根結(jié)線蟲(chóng)重發(fā)區(qū)，土樣根結(jié)線蟲(chóng)普遍率達(dá)40.25%，而在根結(jié)線蟲(chóng)普遍率高的區(qū)縣，根結(jié)線蟲(chóng)土樣普遍率高達(dá)59.09%，50%的土樣屬于2種及以上根結(jié)線蟲(chóng)混合侵染，為根結(jié)線蟲(chóng)的防控增加了難點(diǎn)。以往研究結(jié)果表明，水灌溉和非寄主作物輪作是防控根結(jié)線蟲(chóng)病害的有效手段[11]。一般認(rèn)為，水旱輪作中水稻生長(zhǎng)期淹水時(shí)間長(zhǎng)能滿足防治線蟲(chóng)的淹水條件[11];而在冬季間種芥末和小油菜，然后再間種水稻和芝麻，土壤中擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)數(shù)能降低65%[21];烤煙與菽麻Crotalaria juncea間作對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病防效為64.23%[22];高丹草Sorghum bicolor × sudanense與感病蔬菜輪作亦能明顯減少根結(jié)線蟲(chóng)種群數(shù)量[23]。然而，此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)侵染水稻的擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)已成為成都平原的優(yōu)勢(shì)種，擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)與其他根結(jié)線蟲(chóng)的混合發(fā)生降低了水旱輪作和不同作物輪作、套作和間作的根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果，并將使成都平原水旱輪作田根結(jié)線蟲(chóng)的發(fā)生和危害進(jìn)一步加重。

利用根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物PCR擴(kuò)增鑒定出這些地區(qū)共5種根結(jié)線蟲(chóng)，包括發(fā)生率高的擬禾谷根結(jié)線蟲(chóng)和花生根結(jié)線蟲(chóng)，其次南方根結(jié)線蟲(chóng)，北方根結(jié)線蟲(chóng)常有發(fā)生，爪哇根結(jié)線蟲(chóng)零星發(fā)生。劉國(guó)坤等[24]發(fā)現(xiàn)水稻田周邊雜草油芒Eccoilopus sp.是水稻根結(jié)線蟲(chóng)的寄主，來(lái)自油芒的根結(jié)線蟲(chóng)能?chē)?yán)重侵染水稻，油芒根部根結(jié)卵囊孵化產(chǎn)生的2齡幼蟲(chóng)通過(guò)灌溉水進(jìn)入水稻田，成為水稻根結(jié)線蟲(chóng)病的重要侵染源，導(dǎo)致該區(qū)域水稻嚴(yán)重侵染。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)田埂，稻田周邊旱地、綠化帶以及水渠破損處都生長(zhǎng)有大量雜草，多為根結(jié)線蟲(chóng)適宜的寄主，導(dǎo)致根結(jié)線蟲(chóng)可能通過(guò)雨水、灌溉水從稻田周邊環(huán)境中侵入稻田。水渠灌溉水、稻田之間自流灌溉以及成都平原稻田的跨區(qū)域機(jī)械化耕作，同樣也將導(dǎo)致根結(jié)線蟲(chóng)的長(zhǎng)距離傳播使得該區(qū)域根結(jié)線蟲(chóng)分布更加廣泛和嚴(yán)重。

本次研究發(fā)現(xiàn)成都平原地區(qū)水旱輪作田根結(jié)線蟲(chóng)分布廣泛、種類多樣，多數(shù)田塊不同種類混合發(fā)生，迫切需要進(jìn)一步深入研究，尋找可利用的非寄主作物輪作減少根結(jié)線蟲(chóng)基數(shù)，阻斷各種侵染來(lái)源，篩選有效的輪作植物、防治藥劑，并且協(xié)助育種家加速抗根結(jié)線蟲(chóng)品種的選育，為制定科學(xué)合理的綜合防控措施提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）