閆多子 蔡霓 農(nóng)向群 王廣君 涂雄兵 張澤華

摘要 金龜子綠僵菌能夠寄生昆蟲，也能與植物共生。黏附素MAD1是綠僵菌與宿主互作初期的黏附因子。已知它在昆蟲的侵染和致病中起重要作用，但與植物的互作機制報道甚少。為了研究MAD1在綠僵菌與植物共生中的作用，我們通過同源重組構(gòu)建了金龜子綠僵菌mad1敲除株，并檢測了敲除株的生長、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)及毒力等生物學(xué)特性，進(jìn)一步利用qRT-PCR分析了MAD1在調(diào)節(jié)花生免疫響應(yīng)中的作用。結(jié)果顯示，與野生型菌株相比，敲除株產(chǎn)孢量降低了43.67%，分生孢子萌發(fā)中時為27.69 h，顯著長于野生型菌株的13.43 h。敲除株對家蠶的半致死時間LT50為8.9 d，較野生型菌株的7.62 d顯著延長。敲除株處理花生6 h后，花生免疫類基因CNGC1、PCD4，抗病基因SWEET10及轉(zhuǎn)錄因子WRKY41、MYB86的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)顯著上調(diào)，而鈣調(diào)素CML5、CML19的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到明顯抑制。本研究證明了mad1是金龜子綠僵菌產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)及毒力的正相關(guān)基因，并且MAD1在金龜子綠僵菌與植物相互作用初期，抑制植物抗性級聯(lián)反應(yīng)，減弱過敏反應(yīng)，降低對微生物的抵御能力，同時增強共生信號的傳導(dǎo)，這些作用有助于金龜子綠僵菌在花生根組織上定殖。

關(guān)鍵詞 金龜子綠僵菌; MAD1; 基因敲除; 共生; 花生

中圖分類號： S 476.12

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020629

Knockout and functional analysis of the adhesin gene mad1 in Metarhizium anisopliae

YAN Duozi1， CAI Ni1， NONG Xiangqun1*， WANG Guangjun1，2， TU Xiongbing1， ZHANG Zehua1

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 2. National Plant Protection

Xilinguole Observation and Experiment Station， Xilinhaote 026000， China）

Abstract

Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus and also an endophyte in plants. The adhesin MAD1 is the adhesion factor in the initial stage of interaction between M.anisopliae and insects or plant hosts. It is known that the adhesin is very important for infection and pathogenicity to insects， but its role in the interaction with plants is still unclear. Here， we aimed to explore the role of MAD1 in the symbiosis between M.anisopliae and plants. We constructed mad1 knockout strain by homologous recombination and tested the biological characteristics such as growth， sporulation， spore germination and virulence of the mad1 mutant. Furthermore， the effect of MAD1 on the peanut defense response was analyzed by qRT-PCR. The results showed that the spore production of the knockout strain reduced by 43.67%， and the spore semi-germination time was 27.69 h， which was significantly longer than 13.43 h of the wild type strain. The semi-lethal time LT50 of the knockout strain against the Bombyx mori was 8.9 d， which was significantly longer than 7.62 d of the wild type strain. In addition，? 6 h after inoculating the knockout strain to peanut， the transcription levels of the immune genes CNGC1 and PCD4， disease resistance gene SWEET10 and transcription factors WRKY41 and MYB86 were significantly up-regulated， while the transcriptional expression of calmodulin CML5 and CML19 were significantly inhibited. This study suggested that mad1 was a positively correlated gene of sporulation， spore germination and virulence in M.anisopliae. Moreover， MAD1 inhibited the plant resistance cascade， weakened the allergic reactions and reduced the resistance to microorganisms， but synchronously enhanced the transduction of symbiotic signals at the initial stage of the interaction between M.anisopliae and plants. These effects were conducive to the colonization of M.anisopliae in peanut root tissues.

Key words

Metarhizium anisopliae; MAD1; gene knockout; symbiosis; peanut

綠僵菌Metarhizium作為一類昆蟲病原真菌，經(jīng)過漫長的適應(yīng)性進(jìn)化，形成了基物腐生、植物共生、昆蟲寄生3種生活方式。由于具有廣泛的殺蟲能力，被用于防治多種農(nóng)林害蟲，如蝗蟲、蠐螬等[1]。綠僵菌的致病機理相對復(fù)雜，有很多基因在綠僵菌對昆蟲寄主的附著、定殖、穿透中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae在昆蟲體表附著時產(chǎn)生黏附蛋白MAD1，促進(jìn)真菌孢子穩(wěn)定地吸附于昆蟲體表，當(dāng)mad1基因缺失后，金龜子綠僵菌分生孢子對寄主體表的黏附能力與毒力都顯著降低[2]。對MAD1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)其含有8個半胱氨酸的CFEM功能域，是真菌細(xì)胞膜蛋白特有結(jié)構(gòu)，可以作為細(xì)胞表面受體或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器，參與細(xì)胞的黏附作用。研究表明mad1的缺失會抑制金龜子綠僵菌附著孢的形成和菌絲體分化，且影響細(xì)胞分裂和細(xì)胞骨架的形成[2]。所以研究MAD1對綠僵菌分生孢子的發(fā)育調(diào)控以及對菌株毒力的影響有重要作用。

近年研究發(fā)現(xiàn)，綠僵菌能夠在植物根際和根內(nèi)宿存，促進(jìn)植物生長[3-5]。據(jù)檢測，綠僵菌屬真菌可以成功定殖于單子葉和雙子葉植物根表皮，包括番茄Lycopersicon esculentum、蠶豆Vicia faba、油菜Brassica napus和菜豆Phaseolus vulgaris等[6-9]。有研究表明種植木薯Manihot esculenta的土壤用金龜子綠僵菌孢子懸浮液浸泡7～9 d后，木薯近根端金龜子綠僵菌定殖水平達(dá)80%。且在接種47 d后，定殖水平并未出現(xiàn)下降趨勢[10]。Lahey等[11]通過對羅伯茨綠僵菌Metarhizium robertsii處理的玉米和大豆根表面和內(nèi)部進(jìn)行綠僵菌菌落數(shù)（cfu）的檢測，發(fā)現(xiàn)植物莖基部下胚軸菌落數(shù)較多，表明綠僵菌可以定殖于植物根部，且對莖基部下胚軸部位有嗜好性。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌可以抑制植物的基礎(chǔ)免疫能力，同時促進(jìn)植物生長及與微生物共生相關(guān)基因的表達(dá)。此外羅伯茨綠僵菌產(chǎn)生的3-吲哚乙酸可激活I(lǐng)AA調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，刺激擬南芥Arabidopsis thaliana根系生長[13]。雖然目前已有很多研究證實綠僵菌可以在植物根部定殖，但綠僵菌作為植物內(nèi)生菌其黏附、定殖于植物的過程和機理研究甚少。而MAD1是否參與介導(dǎo)綠僵菌在植物上的黏附、定殖及其與植物互作的機制尚未見報道。為了研究黏附素MAD1在綠僵菌與植物互作中的作用，我們構(gòu)建了mad1敲除突變株，并檢測了其生長速率、萌發(fā)率、產(chǎn)孢量以及對家蠶Bombyx mori 的致死率等生物學(xué)特性，還檢測了野生型菌株、突變株處理下的花生免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，以期為分析MAD1的功能作用、闡述綠僵菌與植物的互作機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物材料

供試植物為花生Arachis hypogaea‘魯花11品系，從農(nóng)資商店采購。

金龜子綠僵菌 M.anisopliae Ma9-41為本實驗室保存的潮霉素敏感菌株。

克隆載體PBM23含T7啟動子及多克隆位點，購自博邁德生物公司。

基因敲除載體pKH-KO含潮霉素hyg抗性基因和氨芐青霉素Amp抗性基因，可以一步在hyg的兩側(cè)同時插入上下游同源重組片段，該載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所李梅研究員饋贈。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTM 1st strand cDNA synthesis kit、限制性內(nèi)切酶Xba I、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司，DNA純化回收試劑盒、裂解酶 Lysing Enzyme from Trichoderma 購自威萊博生物技術(shù)有限公司。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSAY）：1 000 mL中含馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂18 g，酵母粉5 g。

SDAY培養(yǎng)基：1 000 mL中含酵母粉10 g，葡萄糖40 g，蛋白胨10 g。

產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基：1 000 mL中含硫酸鎂2 g，酵母粉10 g，蔗糖20g，磷酸氫二鉀5 g。

原生質(zhì)體buffer：蝸牛酶0.2 g，用20 mL滅菌的0.7 mol/L的NaCl溶液溶解，0.45 μm的無菌濾器過濾。

TB3固體培養(yǎng)基：TB3中加入10%～15%的瓊脂粉，121℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.3 mad1敲除突變株的構(gòu)建

1.3.1 敲除載體的構(gòu)建

以 pKH-KO質(zhì)粒DNA為模板，分別擴增潮霉素抗性基因hyg全長序列和加XbaⅠ和Hind Ⅲ 酶切位點的hyg。以金龜子綠僵菌Ma9-41基因組DNA為模板，分別擴增mad1基因的上游同源臂序列S1以及加有酶切位點XbaⅠ和Hind Ⅲ的下游同源臂序列S2。將擴增的hyg和S1分別連接到克隆載體PBM23上，獲得重組載體PBM23-hyg和PBM23-S1。通過定點酶切和連接，將帶有XbaⅠ和Hind Ⅲ酶切位點的hyg基因連接到PBM23-S1載體上，獲得敲除載體PBM23-S1-hyg，同理，將帶有XbaⅠ和Hind Ⅲ 酶切位點的S2基因連接到PBM23-hyg載體上，獲得敲除載體PBM23-hyg-S2（圖1）。所用引物信息見表1。

1.3.2 敲除片段的獲得

以敲除載體PBM23-S1-hyg的質(zhì)粒DNA為模板，擴增獲得敲除片段1：S1+hyg前2/3片段;以敲除載體PBM23-hyg-S2的質(zhì)粒DNA為模板，擴增得到敲除片段2：hyg后2/3片段+S2。所用引物信息見表1。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各4 μL，DNA 2 μL，補足RNase-free water（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）至50 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Biomed回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.3.3 敲除片段的轉(zhuǎn)化

參照王曉玲等[14]的CaC12-PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將敲除片段S1+hyg前2/3片段、hyg后2/3片段+S2轉(zhuǎn)入金龜子綠僵菌Ma9-41原生質(zhì)體中。其過程主要包括金龜子綠僵菌分生孢子在產(chǎn)菌絲培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 h獲得幼嫩菌絲，并在原生質(zhì)體緩沖液中于30℃下酶解獲得原生質(zhì)體;將敲除片段導(dǎo)入金龜子綠僵菌原生質(zhì)體中，與40% PEG 8000孵育20 min;最后在含低熔點瓊脂糖的TB3固體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp， 300 μg/mL潮霉素）上28℃恒溫培養(yǎng)3 d，獲得菌落為假定轉(zhuǎn)化子。

1.3.4 轉(zhuǎn)化子篩選及鑒定

挑選60個假定轉(zhuǎn)化子，分別轉(zhuǎn)接至含300 μg/mL潮霉素的PSAY 培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)5代。選取第5代的所有轉(zhuǎn)化子，分別利用真菌提取試劑盒（北京天漠科技開發(fā)有限公司）提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，以S1-F， 2/3hyg-R為引物擴增S1+hyg前2/3片段;以mad1-F/mad1-R為引物擴增mad1基因。同時以野生型菌株Ma9-41為對照進(jìn)行擴增。擴增結(jié)果為S1+hyg前2/3片段陽性且mad1陰性的轉(zhuǎn)化子初步判斷為敲除菌株（Δmad1），挑選4株敲除菌株進(jìn)行cDNA驗證，檢測mad1基因，保存陽性菌株，選取一個陽性轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)試驗。

1.4 野生型菌株與敲除株生物學(xué)特性比較

1.4.1 野生型菌株和mad1敲除株生長速率及產(chǎn)孢量測定

參照蔡守平等[15]的方法并加以改善。將活化的金龜子綠僵菌野生型菌株Ma9-41、敲除株Δmad1的分生孢子用0.1%的吐溫 -80配成1.0×106個/mL的孢子懸浮液，用微量移液器取10 μL分別點滴接種于 PSAY平板中央，各重復(fù)5次，于26℃培養(yǎng)。從第3天開始，每天用電子數(shù)顯卡尺以十字交叉法測量1次菌落直徑，取5個重復(fù)菌落的平均值，觀察測量至第11天共9次，比較敲除株和野生型菌株的菌落生長速率。待培養(yǎng)12 d后菌落表面完全覆蓋分生孢子時，用直徑5 mm的打孔器在距離菌落中心1/2處打取菌餅，每菌落按十字對稱取4個菌餅，置于定量的01%的吐溫 -80無菌水溶液中，振蕩使孢子充分分散。用血球計數(shù)板測定孢子濃度并換算成單位面積的產(chǎn)孢量，各菌株重復(fù)測定5次。

1.4.2 野生型菌株和mad1敲除株萌發(fā)率測定

參照曹月青等[16]的方法將金龜子綠僵菌野生型菌株Ma9-41、敲除株Δmad1的分生孢子置于含5 mL SDAY的試管中，調(diào)整孢子濃度為106個/mL，取10 μL孢子懸浮液滴加在載玻片上，涂成直徑約1 cm的圓點，小心將其置于鋪有2層濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在28℃保濕培養(yǎng)，于6、12、24、48 h后在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，孢子萌芽長度大于孢子長度的一半視為萌芽，計數(shù)萌芽與未萌芽的孢子數(shù)量。每個時間點檢測3個載玻片，每片觀察的視野不少于100個孢子。計算萌發(fā)率及萌發(fā)中時。

分生孢子萌發(fā)率=（孢子萌發(fā)總數(shù)/鏡檢孢子總數(shù)）×100%。

萌發(fā)中時采用Excel 2010進(jìn)行回歸分析得出金龜子綠僵菌孢子萌發(fā)率與萌發(fā)時間的回歸直線方程和相關(guān)性，計算孢子萌發(fā)率達(dá)到50%所需時間。

1.4.3 野生型菌株和mad1敲除株對家蠶毒力測定

采用噴霧法測定[17]。將野生型菌株Ma9-41與敲除株Δmad1分生孢子分別置于0.05%吐溫-80中，配制成濃度為3×108個/mL的分生孢子懸浮液備用。將3齡家蠶（山東青州廣通蠶農(nóng)場室內(nèi)飼養(yǎng)）饑餓處理4 h后分配到已消毒的25 cm×20 cm×9 cm生測框內(nèi)，每框30頭，每處理重復(fù)5框。接種處理時，將每框試蟲分散置于直徑為10 cm的無菌培養(yǎng)皿中，使用噴霧塔（Burkard Potter Precision Laboratory）噴施4 mL菌液，移回框內(nèi)，1 h后每框給足量桑葉飼喂，試驗在（28±2）℃，相對濕度為40%～65%的室內(nèi)進(jìn)行。處理后第3天開始記錄家蠶死亡數(shù)，計算累計死亡率。

累計死亡率=（死亡總蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)）×100%。

1.5 黏附素MAD1誘導(dǎo)花生免疫相關(guān)基因的響應(yīng)

孢子懸浮液的制備。將Ma9-41、敲除株Δmad1接種于PSAY培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)14 d，收集分生孢子，用滅菌的0.1%吐溫-80水溶液配制并調(diào)整終濃度至1×108個/mL。

花生種植及接菌處理?；ㄉN子表面消毒參照Sara等[18]的方法，于70%乙醇中浸泡1 min，無菌水沖洗3次，再用1%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，無菌水沖洗3次，完成消毒。將消毒后的種子置于含有50 mL ddH2O的直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，并置于28℃黑暗培養(yǎng)箱中催芽24 h。挑選健康且萌芽一致的種子播種于裝滿滅菌蛭石的花盆中，于培養(yǎng)室（28℃，L∥D=14 h∥10 h，相對濕度40%～65%）中培養(yǎng)7 d至花生二葉期。挑選生長一致的植株，小心連根取出，將根部蛭石用蒸餾水沖洗干凈，用1×108個/mL的金龜子綠僵菌Ma9-41、敲除株Δmad1孢子懸浮液浸泡花生根部，每個處理重復(fù)3株。處理6 h后將根取出，用吸水紙吸干，立即置于液氮中。快速將根剪成5～8 mm，同一處理不同的重復(fù)進(jìn)行混樣并分成 3份，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。取花生根樣品，置于液氮中研磨，然后用TRIzol試劑盒（Invitrogen）提取總RNA。用Prime ScriptTM 1st strand cDNA synthesis kit（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。并用NanoPhotometer微量分光光度計（IMPLEN， 德國）檢測濃度。

實時熒光定量 PCR檢測?；谥暗霓D(zhuǎn)錄組分析確定候選基因設(shè)計的引物序列見表2，內(nèi)參基因選用60S 核糖體蛋白L7（RPL7）。用SYBR Green熒光定量試劑盒（TaKaRa）在7500型（ABI）實時熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系為2×SYBR Green Master Mix 10 μL， 10 μmol/L正、反向引物各1 μL，cDNA 0.8 μL，補足RNase-free water至20 μL。PCR擴增程序為95℃預(yù)變性2 min;95℃變性5 s，60℃復(fù)性30 s，40個循環(huán)。每樣品3次技術(shù)重復(fù)，基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0進(jìn)行分析，分析結(jié)果采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 mad1敲除突變株的構(gòu)建

2.1.1 敲除載體的構(gòu)建

用設(shè)計的mad1上、下游同源臂序列的特異性引物，從金龜子綠僵菌野生型菌株Ma9-41基因組DNA中擴增獲得mad1上游同源臂序列S1，帶有XbaⅠ和Hind Ⅲ 酶切位點的下游同源臂序列S2，長度分別為1 092、1 035 bp。以引物hyg-F/-R從質(zhì)粒pKH-KO中擴增得到潮霉素抗性基因hyg，長度為1 426 bp（圖2a）。以敲除載體PBM23-S1-hyg質(zhì)粒DNA為模板，以S1-F、hyg-R為引物，擴增得到S1+hyg片段，長度為2 529 bp。以敲除載體PBM23-hyg-S2質(zhì)粒為模板，以hyg-F、S2-R為引物，擴增得到hyg+S2片段，長度為2 455 bp，測序結(jié)果表明敲除載體PBM23-S1-hyg、PBM23-hyg-S2構(gòu)建成功（圖2b）。以測序成功的PBM23-S1-hyg質(zhì)粒DNA為模板，以S1-F、2/3hyg-R為引物，擴增獲得敲除片段S1+hyg前2/3片段，長度為2 037 bp，以測序成功的PBM23-hyg-S2質(zhì)粒DNA為模板，以1/3hyg-F、S2-R為引物，擴增獲得敲除片段hyg后2/3片段+S2，長度為1 954 bp（圖2c）

2.1.2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及敲除株的驗證

利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將敲除片段S1+hyg前2/3片段、hyg后2/3片段+S2轉(zhuǎn)入Ma9-41原生質(zhì)體中，獲得原生質(zhì)體再生細(xì)胞，通過繼代抗性篩選獲得假定轉(zhuǎn)化子。提取第5代轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，并擴增mad1基因及S1+hyg前2/3片段，以野生型菌株Ma9-41為對照。結(jié)果 60個假定轉(zhuǎn)化子中有7個成功擴增出S1+hyg前2/3片段，但未擴增出mad1基因，表明mad1敲除成功（圖3a，b）。這7個陽性轉(zhuǎn)化子分別為2-21，2-24，1-11，1-19，1-26，1-27，1-29，以其中4株陽性轉(zhuǎn)化子的cDNA為模板，擴增 mad1基因（圖3c），進(jìn)一步驗證mad1基因敲除成功。

2.2 mad1敲除株的生物學(xué)特性變化

2.2.1 野生型菌株和mad1敲除株的生長速率和產(chǎn)孢量

對野生型菌株Ma9-41與Δmad1在PSAY培養(yǎng)基上生長3～11 d的菌落直徑分析顯示，二者的菌落生長速率無顯著差異（t測驗，P>0.05）（圖4）。產(chǎn)孢量有顯著差異（表3），野生型菌株Ma9-41在第11天的產(chǎn)孢量為（5.06±1.26）×108個/cm2，而Δmad1菌株在第11天測得產(chǎn)孢量為（2.85±0.35）×108個/cm2，與Ma9-41相比，Δmad1產(chǎn)孢量下降了43.67%，表明mad1的敲除明顯抑制了真菌產(chǎn)孢。

2.2.2 野生型菌株和mad1敲除株的孢子萌發(fā)率比較

野生型菌株Ma9-41和敲除株Δmad1孢子懸浮液制成的載玻片在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，結(jié)果表明， Δmad1菌株的萌發(fā)率在6、12、24、48 h均顯著低于野生型菌株（P<0.05）（圖5）。經(jīng)計算Ma9-41菌株的萌發(fā)中時為13.43 h，而Δmad1菌株的萌發(fā)中時為27.69 h，顯著長于野生型菌株，表明mad1的缺失抑制真菌的萌發(fā)。

2.2.3 野生型菌株和mad1敲除株對家蠶的毒力

在噴霧接種3×108個/mL分生孢子懸浮液的條件下，處理第9天時，野生型菌株Ma9-41處理的家蠶累計死亡率達(dá)到85.56%，Δmad1處理的家蠶的累計死亡率為56.67%，毒力顯著降低。Ma9-41處理的LT50為7.62 d， Δmad1處理的LT50為8.9 d，這些結(jié)果表明mad1基因主要在金龜子綠僵菌侵染家蠶后期發(fā)揮毒力作用（圖6）。

2.3 黏附素MAD1誘導(dǎo)花生響應(yīng)的作用分析

通過檢測野生型菌株Ma9-41、Δmad1處理花生根后8個免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)處理6 h后，與野生型菌株相比，Δmad1顯著促進(jìn)了免疫正調(diào)控因子WRKY41的轉(zhuǎn)錄，且差異倍數(shù)高達(dá)3.27倍;同時，環(huán)核苷酸門控通道CNGC1、抗逆轉(zhuǎn)錄因子MYB86、過敏反應(yīng)引起的細(xì)胞程序性死亡基因PCD4、抗病基因SWEET10的轉(zhuǎn)錄水平也相對升高，轉(zhuǎn)錄水平分別是野生型菌株的1.7、1.3、1.4、116倍（圖7）。相反，Δmad1顯著抑制了鈣調(diào)素CML5、CML19的轉(zhuǎn)錄水平，抑制程度分別為野生型菌株的033、0.44倍。由此結(jié)果得出，MAD1在金龜子綠僵菌接種花生植株初期6 h即可發(fā)揮作用，顯著抑制植株的免疫反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)，同時調(diào)控CML的相關(guān)反應(yīng)。

3 討論

MAD1作為黏附性蛋白，在綠僵菌與寄主（包括昆蟲和植物）的互作初始識別中發(fā)揮重要作用，但是關(guān)于它的生物學(xué)功能研究甚少，本研究通過mad1缺失突變株證明，MAD1與金龜子綠僵菌產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)及對家蠶的毒力相關(guān)。

MAD1在綠僵菌與植物識別中的作用未見報道。前人研究表明綠僵菌可以抑制花生根細(xì)胞微生物識別受體相關(guān)基因，對花生細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行重編程，促進(jìn)植物共生基因SYMRK、CaM、CCaMK的轉(zhuǎn)錄，從而有利于綠僵菌的侵染定殖及植物生長[12，19]。然而，這種有益互作的機制還遠(yuǎn)未闡明。植物與微生物的交流源于兩者相互感知及識別，而植物細(xì)胞識別微生物早期信號事件之一是Ca2+內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在與植物的共生途徑中，會存在鈣離子的激增現(xiàn)象[20]。CMLs（鈣調(diào)素類蛋白）具有保守的Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在共生過程中具有信號傳導(dǎo)的功能[21-22]。Jongho等[23]研究發(fā)現(xiàn)植物在受到叢枝菌根真菌根內(nèi)球囊霉Rhizophagus irregularis侵染后，胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高，推測 Ca2+-CaM/CML 信號通路被激活，最后促使植物與該真菌建立穩(wěn)定的共生關(guān)系。WRKY是植物抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物與微生物互作[24]。擬南芥接種丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000）后誘導(dǎo)了WRKY41表達(dá)，表明WRKY41在擬南芥的抗逆中起著正調(diào)控作用[25]。CML可以與WRKY結(jié)合，調(diào)控植物免疫反應(yīng)[26]。環(huán)核苷酸門控通道（CNGCs）是控制Ca2+穿過細(xì)胞膜的非選擇陽離子通道，將Ca2+傳導(dǎo)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，作為病原體免疫信號級聯(lián)的早期事件，介導(dǎo)植物的抗性[27-28]。研究表明，煙草在受茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum誘導(dǎo)后，根中CNGC1高量表達(dá)，證明CNGC1是煙草青枯病抗性基因[29]。MYB86是一種轉(zhuǎn)錄阻遏子，應(yīng)答環(huán)境變化與激素調(diào)節(jié)，與植物防御反應(yīng)有關(guān)[30]。PCD4是細(xì)胞程序性死亡基因，是植物為了抵御病原物侵染而誘發(fā)局部的細(xì)胞死亡，可以將病原物限制在侵染點，阻止病原物的進(jìn)一步擴散[31]。SWEET10編碼一種細(xì)胞膜定位蛋白，具有蔗糖轉(zhuǎn)運功能。有研究表明過表達(dá)SWEET10基因能夠促進(jìn)甘薯品系‘ND98葉片中糖分向外運輸，降低葉片中的糖含量，減少了對病原菌生長繁殖的能量供應(yīng)，提高植物的抗病性。SWEET10的過表達(dá)還可以增強甘薯對尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum的抗性[32]。

本研究中，Δmad1處理花生6 h后，花生根中轉(zhuǎn)錄因子WRKY41、MYB86和免疫相關(guān)基因CNGC1、PCD4以及抗病相關(guān)基因SWEET10均顯著上調(diào)，表明了MAD1在金龜子綠僵菌與植物作用初期，抑制了轉(zhuǎn)錄因子WRKY41、MYB86的轉(zhuǎn)錄水平，可進(jìn)一步抑制花生植株對微生物的抵御能力;CNGC1的表達(dá)受到抑制，可弱化將Ca2+傳導(dǎo)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的能力，抑制植物抗性級聯(lián)反應(yīng);并通過抑制PCD4，削弱植物的過敏反應(yīng)，這些作用均為金龜子綠僵菌在植物上的定殖提供基礎(chǔ)。同時MAD1抑制SWEET10的表達(dá)，可能是MAD1抑制植物的防御使植物與微生物兼容，MAD1抑制植物組織中蔗糖向外運輸，從而為微生物提供能量。重要的是，MAD1增強了兩種CML的轉(zhuǎn)錄水平，提高了與Ca2+的結(jié)合能力，這種機制在植物與微生物的共生信號交流中起著重要作用，有助于金龜子綠僵菌在花生根組織上定殖和建立共生。上述有關(guān)MAD1誘導(dǎo)調(diào)節(jié)植物免疫和共生相關(guān)基因的功能分析，可作為進(jìn)一步闡述MAD1參與金龜子綠僵菌與植物定殖和共生機制的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）