朱軼慧 劉玉軍 畢飛虎 蔣歡 趙本文 魯林琴 陳名君

摘要 紅葉石楠是我國(guó)園林綠化常用的彩葉樹(shù)種。近來(lái)，安徽合肥市紅葉石楠葉斑病發(fā)生嚴(yán)重，導(dǎo)致葉片枯萎脫落甚至植株死亡，嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值。為科學(xué)防控紅葉石楠葉斑病，對(duì)其病原菌種類(lèi)和生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。本研究采用組織分離法獲得紅葉石楠葉斑病的病原菌，并通過(guò)顯微形態(tài)觀察結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的方法，最終將其病原菌鑒定為小孢擬盤(pán)多毛孢Pestalotiopsis microspora。生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明：適宜菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源和最佳氮源分別為蔗糖和蛋白胨，最適生長(zhǎng)溫度和pH分別為25℃和6。研究結(jié)果為該病害的正確診斷提供了較為可靠的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 紅葉石楠; 葉斑病; 小孢擬盤(pán)多毛孢; 分子鑒定; 生物學(xué)特性

中圖分類(lèi)號(hào)： S 436.85

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2020280

Identification and biological characteristics of the pathogen causing leaf spot disease on Photinia×fraseri

ZHU Yihui1， LIU Yujun2， BI Feihu1， JIANG Huan1， ZHAO Benwen1， LU Linqin1， CHEN Mingjun1*

（1. Anhui Provincial Key Laboratory of Microbial Control， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China;

2. Anhui Academy of Science and Technology， Hefei 230031， China）

Abstract

Photinia×fraseri has commonly been used as color leaf landscaping tree in China. Recently， the leaf spot disease of Photinia×fraseri has seriously occurred in Hefei， Anhui， and causes the leaf to wither and fall off or the plant to die， which greatly lost its ornamental value. In order to effectively control the disease， the identification and biological characteristics of the pathogen were investigated. The pathogen was obtained by tissue isolation from the infected Photinia×fraseri leaves， and was identified as Pestalotiopsis microspora according to microscopically morphological observation and phylogenetic tree. The results showed that the optimal carbon source and nitrogen source were glucose and peptone， respectively. The optimal growth temperature and pH value were 25℃ and 6.0， respectively. The results will provide a scientific basis for the correct diagnosis of the leaf spot disease on Photinia×fraseri.

Key words

Photinia×fraseri; leaf spot disease; Pestalotiopsis microspora; molecular identification; biological characteristics

紅葉石楠Photinia×fraseri Dress屬薔薇科、石楠屬的雜交樹(shù)種，為灌木或常綠小喬木，因其鮮紅的嫩葉、新梢而得名[1]，亦有“紅葉綠籬之王”和“紅衣衛(wèi)士”等美譽(yù)[2]?！t羅賓和‘紅唇是紅葉石楠中常見(jiàn)的兩個(gè)品種，前者因?yàn)楦吁r艷亮麗的葉子，更具有觀賞性。紅葉石楠憑借其強(qiáng)大的生命力，在溫暖潮濕和低溫干燥的環(huán)境下都可以良好生長(zhǎng)，色彩持久鮮艷。因此，在城市園林建設(shè)中應(yīng)用越來(lái)越廣泛[3]，也常被用于道路邊坡固土建設(shè)[4]。近年來(lái)，紅葉石楠引起研究者們極大興趣，但主要集中在紅葉石楠栽培技術(shù)[5]、生理特征[6]和干旱脅迫[7]等方面。隨著紅葉石楠種植范圍和規(guī)模的擴(kuò)大，病害發(fā)生情況也日趨嚴(yán)重[8]。發(fā)生在紅葉石楠上的常見(jiàn)病害多為葉部病害。如：紅葉石楠葉斑病、灰霉病、炭疽病、銹病、白粉病、煤污病、黃化病等[8]。但有關(guān)紅葉石楠病害病原菌的分離鑒定和生物學(xué)特征研究少見(jiàn)報(bào)道。

近年來(lái)，對(duì)合肥市區(qū)紅葉石楠病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有一種葉斑病對(duì)紅葉石楠的為害程度十分嚴(yán)重且發(fā)展迅速。染病初期，葉片出現(xiàn)零星褐色小斑點(diǎn)，發(fā)病后期褐色斑點(diǎn)布滿(mǎn)整個(gè)葉面導(dǎo)致整葉枯死。病原菌可以多次侵染，所以病害經(jīng)常反復(fù)發(fā)生，嚴(yán)重影響了紅葉石楠的觀賞價(jià)值。本文采集感病葉片，通過(guò)組織分離、柯赫氏法則驗(yàn)證、病原菌形態(tài)學(xué)觀察并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)等方法，鑒定了該病害的病原種類(lèi)，系統(tǒng)研究了病原菌的生物學(xué)特性，為該病害的正確診斷和及時(shí)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

2019年春季，在合肥市安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園及農(nóng)萃園內(nèi)，采用五點(diǎn)取樣法采集約20年生的紅葉石楠感病葉片。每點(diǎn)隨機(jī)選取10株紅葉石楠，每株紅葉石楠隨機(jī)選取10片病葉做標(biāo)記，每15 d左右記錄觀察癥狀發(fā)生發(fā)展?fàn)顩r。

1.2 病原真菌的分離與純化

本試驗(yàn)采用組織分離法分離病原真菌，將每片病葉病斑及周?chē)M織一并剪下作為分離材料。分離材料先用無(wú)菌水清洗5 s，重復(fù)3次，再在75%乙醇中消毒5 s，最后在無(wú)菌水中清洗5 s，并用無(wú)菌紙吸去水分，放置在無(wú)菌培養(yǎng)皿上晾干。用剪刀將分離材料剪成約3 mm×3 mm小塊，于超凈工作臺(tái)中將剪好的病組織轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基（葡萄糖20 g/L、去皮土豆200 g/L、瓊脂20 g/L）上。每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放置3片病葉組織，并在培養(yǎng)皿上注明日期、編號(hào)，置于25℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。約4 d后挑取病葉組織邊緣的菌絲進(jìn)行分離純化，純化得到的菌株儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。

1.3 病原菌形態(tài)觀察和分子鑒定

將純化后得到的菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d左右，記錄菌落正反面顏色、形狀、質(zhì)地等特征。待產(chǎn)生孢子后，顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子形狀和大小，并拍照記錄。

將從自然感病葉片分離的菌株AH1900408、AH190412、AH190413、AH190414，柯赫氏法則試驗(yàn)分離得到的菌株AH190409、AH190410和AH190411接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約3 d，待長(zhǎng)出大量菌絲后收集菌絲并采用CTAB法提取總DNA，以ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，測(cè)序整理后得到的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，參考文獻(xiàn)并從GenBank中篩選出相關(guān)菌株的ITS序列，用MEGA 6.06軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以狹窄平截盤(pán)多毛孢Truncatella angustata為外群，構(gòu)建rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 致病性測(cè)定

采用孢子接種法和菌絲接種法對(duì)菌株進(jìn)行室內(nèi)離體致病性測(cè)定，選擇健康紅葉石楠的葉片，挑選老葉、中齡葉和嫩葉3種狀態(tài)的葉片進(jìn)行有傷接種（針刺法）處理。用無(wú)菌的昆蟲(chóng)針刺傷紅葉石楠葉片，取菌液濃度為1.0×106孢子液10 μL和相同培養(yǎng)時(shí)的約3 mm菌絲塊點(diǎn)接在上述接種點(diǎn)上（每種葉片各5片，每片葉片5個(gè)接種點(diǎn)）。以點(diǎn)接無(wú)菌水為空白對(duì)照。接種后置于生物測(cè)定箱中25℃恒溫保濕培養(yǎng)（濕度80%，L∥D=12 h∥12 h），每天觀察記錄并計(jì)算其發(fā)病率，再對(duì)新產(chǎn)生的病斑進(jìn)行病原菌的分離。發(fā)病率=發(fā)病葉片數(shù)/總?cè)~片數(shù)×100%。

1.5 生物學(xué)特性分析

1.5.1 最佳碳源試驗(yàn)

在PDA培養(yǎng)基里分別加入2%的乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉，配成不同碳源的培養(yǎng)基，并設(shè)置PDA為空白對(duì)照組， 121℃滅菌20 min。用直徑5 mm的打孔器取菌餅接種于上述的培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)5次。各處理在培養(yǎng)1 d后采用十字交叉法每天進(jìn)行測(cè)量，記錄菌落的平均直徑。試驗(yàn)結(jié)果用SPSS進(jìn)行差異顯著性分析。菌絲生長(zhǎng)速度（mm/d）=菌落平均直徑（mm）/生長(zhǎng)天數(shù)（d）。

1.5.2 最佳氮源試驗(yàn)

在配制好的PDA中分別加入0.2%的蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、牛肉膏和尿素，配制成本研究所需的培養(yǎng)基。試驗(yàn)方法與1.5.1相同。

1.5.3 最適溫度試驗(yàn)

配制PDA培養(yǎng)基，接種與數(shù)據(jù)處理方法同1.5.1。分別于16、20、23、25、28℃與37℃的培養(yǎng)箱里進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)溫度重復(fù)5次。

1.5.4 最適 pH試驗(yàn)

配制PDA培養(yǎng)基，用鹽酸和氫氧化鈉將pH分別調(diào)到4、5、6、7、8、9，接種與數(shù)據(jù)處理方法同1.5.1，每組重復(fù)5次。接種后置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅葉石楠葉斑病病癥、病原菌形態(tài)特征及致病性測(cè)定

在自然發(fā)病的植株上，病菌既可危害嫩葉也可危害中齡葉和老葉。感病初期，葉片上產(chǎn)生褐色小斑點(diǎn)，通常整個(gè)葉片都可感染。之后病斑逐漸擴(kuò)大，呈不規(guī)則形，病健交界處有一圈較窄的黃色暈圈，內(nèi)側(cè)為較寬的紅色暈圈，病斑中央顏色變成灰白色;發(fā)病后期葉片正面著生黑色顆粒物且整個(gè)葉片變成黑黃色枯萎（圖1a）。經(jīng)組織分離得到的菌落為圓形具輪紋，菌絲初期白色，后期顏色加深，呈現(xiàn)灰白色，絨毛狀;菌落邊緣整齊，菌落背面初期呈黃白色，后期呈黃褐色和褐色，輪紋較明顯。培養(yǎng)10 d左右，菌落上產(chǎn)生黑色墨汁狀分生孢子團(tuán)，初期顆粒較小，后逐漸增大，分布較密（圖1b～c）。

菌株培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上7 d左右可長(zhǎng)滿(mǎn)直徑90 mm的培養(yǎng)皿。菌落圓形，取菌絲于載玻片上置于顯微鏡下觀察，分生孢子梗短，無(wú)色;分生孢子為紡錘形，具有4個(gè)隔膜將其分割成5個(gè)細(xì)胞，隔膜明顯但分割處縊縮不明顯，孢子直或稍彎曲，（22.5～26.4）μm×（6.2～8.3）μm。中間3個(gè)細(xì)胞有色，成熟后，3個(gè)有色細(xì)胞中，前面兩個(gè)細(xì)胞顏色最深，為褐色，第3個(gè)有色細(xì)胞顏色較淺，為淡褐色;兩端細(xì)胞無(wú)色透明，為三角形，頂端細(xì)胞著生2～4根（多數(shù)為3根）無(wú)色附屬絲，不分枝，長(zhǎng)約26～38 μm;基部細(xì)胞著生1根中生式尾毛，長(zhǎng)2.5～6.2 μm（圖1）。從該菌形態(tài)特征，查閱文獻(xiàn)[9-11]可初步鑒定為小孢擬盤(pán)多毛孢Pestalotiopsis microspora。

室內(nèi)接種試驗(yàn)結(jié)果表明，室內(nèi)孢子接種的平均發(fā)病率為894%，菌絲接種的平均發(fā)病率為800%。室內(nèi)接種3 d左右即可觀察到病斑，且病斑發(fā)展迅速（圖1f，h）。組織分離法獲得接種病葉中的病原菌，與林間采集病葉上分離得到的病原菌形態(tài)特征一致（圖1e）。通過(guò)柯赫氏法則證明，所分離得到的病原菌為紅葉石楠葉斑病的致病菌。

2.2 病原菌的分子鑒定

將病原菌AH190408、AH190409、AH190410、AH190411、AH190412、AH190413和AH190414的PCR產(chǎn)物測(cè)序得到的ITS序列，通過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中核酸序列BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果表明，分離得到的菌株與小孢擬盤(pán)多毛孢菌P. microspora的同源性達(dá)100%。

將分離得到的菌株rDNA-ITS序列與GenBank中相關(guān)菌株的基因序列通過(guò)軟件BioEdit進(jìn)行比對(duì)，再運(yùn)用MEGA 6.06軟件構(gòu)建基于鄰接法的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從構(gòu)建的發(fā)育樹(shù)可以看出，從自然感病病葉上分離得到的病原菌菌株AH1900408、AH190412、AH190413、AH190414以及通過(guò)柯赫氏法則試驗(yàn)分離得到的菌株AH190409、AH190410、AH190411，都與模式菌小孢擬盤(pán)多毛孢菌P. microspora菌株DQ456865和DQ001009親緣關(guān)系最近，為同一分支（圖2），進(jìn)一步說(shuō)明所分離的病原菌為小孢擬盤(pán)多毛孢。結(jié)合形態(tài)特征、分子鑒定以及致病性測(cè)定結(jié)果，可以確定紅葉石楠葉斑病病原為小孢擬盤(pán)多毛孢。

2.3 紅葉石楠葉斑病的生物學(xué)特性

2.3.1 不同碳源對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的影響

由表2可知，小孢擬盤(pán)多毛孢在不同的碳源條件下，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度差異并不明顯。以蔗糖為碳源時(shí)，生長(zhǎng)速度最快，達(dá)到5.29 mm/d，菌絲長(zhǎng)勢(shì)良好。葡萄糖和麥芽糖作為碳源時(shí)，生長(zhǎng)速度接近，分別為5.21 mm/d和5.19 mm/d，長(zhǎng)勢(shì)良好。乳糖為碳源時(shí)的生長(zhǎng)速度 5.10 mm/d，菌絲潔白且致密。碳源為可溶性淀粉時(shí)生長(zhǎng)速度為485 mm/d，菌絲顏色淺白且長(zhǎng)勢(shì)較差。說(shuō)明該小孢擬盤(pán)多毛孢對(duì)于各種碳源的吸收都比較好，最適碳源為蔗糖。

2.3.2 不同氮源對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的影響

由表3可知，在不同的氮源條件下，菌絲的生長(zhǎng)勢(shì)及生長(zhǎng)速度差異不明顯。比較而言，當(dāng)?shù)鞍纂俗鳛榈磿r(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快，可以達(dá)到5.73 mm/d，菌絲潔白且致密。當(dāng)提供的氮源為NH4NO3、NaNO3和牛肉膏時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度較快，分別為558、5.69 mm/d和5.65 mm/d，生長(zhǎng)旺盛，菌絲潔白致密。但當(dāng)?shù)礊椋∟H4）2SO4時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度略低，為5.51 mm/d。由此可知，該菌對(duì)有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮吸收的差異并不明顯，但相對(duì)而言有機(jī)氮吸收比無(wú)機(jī)氮吸收得更好。在供試有機(jī)氮中以蛋白胨為最佳，無(wú)機(jī)氮中以NaNO3為最佳。

2.3.3 溫度對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的影響

由表4可知，小孢擬盤(pán)多毛孢在16～28℃下均能生長(zhǎng)。當(dāng)溫度為16～25℃時(shí)，溫度與生長(zhǎng)速度呈正相關(guān)，即溫度越高生長(zhǎng)速度越快。其中，當(dāng)溫度為25℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，且生長(zhǎng)速度最快，可達(dá)到7.82 mm/d。溫度為28℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度次之，生長(zhǎng)速度為7.42 mm/d。當(dāng)溫度為37℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)明顯受到抑制，生長(zhǎng)微弱，僅見(jiàn)微小菌落。

2.3.4 pH對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的影響

由圖3可知，小孢擬盤(pán)多毛孢在pH為6～9條件下均可生長(zhǎng)。pH為4和5時(shí)培養(yǎng)基為液態(tài)，菌絲生長(zhǎng)速度也明顯受到抑制。pH為6時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度略快，培養(yǎng)5 d菌絲生長(zhǎng)直徑達(dá)7.293 cm。但從圖3可見(jiàn)，生長(zhǎng)后期4個(gè)pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響區(qū)別不明顯。由此得出，pH過(guò)高或過(guò)低都不利于該菌絲生長(zhǎng)，且其生長(zhǎng)最適宜的pH為6。

3 討論

擬盤(pán)多毛孢菌屬真菌在自然界中廣泛存在，其大多數(shù)種類(lèi)為植物病原物[12]。本研究分離鑒定出紅葉石楠葉斑病病原為小孢擬盤(pán)多毛孢，這一結(jié)果與管斌等[13]研究結(jié)果相同。小孢擬盤(pán)多毛孢寄主范圍廣泛，是植物重要的病原真菌。熊朝偉等[14]系統(tǒng)研究了油茶葉枯病的病原真菌小孢擬盤(pán)多毛孢的分子鑒定和防治藥劑篩選;陳全助等[15]研究了小孢擬盤(pán)多毛孢引起閩楠葉斑病的分離鑒定及生物學(xué)特性。本試驗(yàn)研究小孢擬盤(pán)多毛孢的生物學(xué)特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)碳源適應(yīng)性比較強(qiáng)，通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速度來(lái)看，對(duì)于各種碳源的吸收都比較好。氮源是構(gòu)成菌體或代謝產(chǎn)物中氮素來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，該菌對(duì)于有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮的吸收差異并不明顯，但總體而言有機(jī)氮中以蛋白胨為最佳，無(wú)機(jī)氮中以NaNO3為最佳。研究發(fā)現(xiàn)，該菌最適生長(zhǎng)溫度是20～28℃，在此溫度下菌絲生長(zhǎng)的速度較快，但當(dāng)溫度大于37℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，據(jù)此可以對(duì)小孢擬盤(pán)多毛孢的流行季節(jié)進(jìn)行預(yù)測(cè)。pH對(duì)小孢擬盤(pán)多毛孢的生長(zhǎng)也有一定的影響，pH為6～9時(shí)菌絲都能較好地生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)的pH是6。這一研究結(jié)果與陳全助等[15]研究有相似之處，但是生物學(xué)特征也有一定差異，這可能與小孢擬盤(pán)多毛孢不同寄主來(lái)源或不同地理來(lái)源菌株生物特征有差異有關(guān)。

目前，化學(xué)防治作為農(nóng)林業(yè)病蟲(chóng)害最主要的防治手段，具有收效迅速、方法簡(jiǎn)單等多種優(yōu)勢(shì)，但是其負(fù)面影響也不容忽視。紅葉石楠作為常見(jiàn)的園林綠化觀賞樹(shù)種，化學(xué)防治葉斑病可能會(huì)對(duì)人體健康和環(huán)境造成較大的危害。因此，通過(guò)研究其生物學(xué)特性，以期預(yù)測(cè)其病害的發(fā)生規(guī)律，采用營(yíng)林措施，通過(guò)改善土壤條件、調(diào)節(jié)紅葉石楠的郁閉度等預(yù)防病害的發(fā)生，為安全有效防治紅葉石楠葉斑病提供參考。

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（責(zé)任編輯：田 喆）