鄧培淵 王林青 袁洪哲 李長看

摘要 為闡明甜菜夜蛾Spodoptera exigua化學感受蛋白識別外源化合物的特性和作用機制，運用Western blotting法分析SexiCSP2蛋白在成蟲各組織的表達譜，熒光競爭結(jié)合試驗法測定SexiCSP2蛋白與25種外源配基的結(jié)合特性，運用分子對接、分子動力學、結(jié)合自由能計算等方法研究SexiCSP2與配基的結(jié)合模式。結(jié)果顯示SexiCSP2在成蟲接觸和非接觸性器官中均有表達，與己醛結(jié)合能力最強，解離常數(shù)為1.3 μmol/L;分子模擬結(jié)果顯示SexiCSP2與己醛結(jié)合形成1個氫鍵，兩者結(jié)合自由能為-32.94 kJ/mol，主要驅(qū)動力為范德華力，主要抑制力為非極性溶劑化能。這些結(jié)果說明SexiCSP2在甜菜夜蛾識別外源化合物中起重要作用，可以作為防控甜菜夜蛾的有效靶標。

關(guān)鍵詞 甜菜夜蛾; 化學感受蛋白; Western blotting; 熒光競爭結(jié)合試驗; 分子動力學

中圖分類號： Q 966

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020372

The binding specificity and mechanism of chemosensory protein SexiCSP2 in the beet armyworm， Spodoptera exigua

DENG Peiyuan， WANG Linqing， YUAN Hongzhe， LI Changkan*

（Zhengzhou Normal University， Research Centre of Biological Species Resources， Zhengzhou 450044， China）

Abstract

To determine the binding characteristics and mechanism of Spodoptera exigua chemosensory proteins （CSPs） in discriminating exogenous compounds， the expression profiles of SexiCSP2 in adult tissues were analyzed by Western blotting， the binding specificities of SexiCSP2 and 25 foreign ligands were tested through fluorescence competitive binding assay. Moreover， the binding pattern was studied by using molecular docking， molecular dynamics simulation and binding free energy calculation methods. The results showed that SexiCSP2 was expressed in both contact and non-contact organs. It had a strongest binding ability to hexanal with a dissociation constant of 13 μmol/L. Molecular simulation results showed that hexanal formed a hydrogen bond with SexiCSP2， and the binding free energy was -32.94 kJ/mol; the van der Wals was the main driving force， and the nonpolar solvation energy was the main resistance force. These data indicated that SexiCSP2 might play an important role in the process of discriminating exogenous compounds and could be used as an effective target for the prevention and control of S.exigua.

Key words

Spodoptera exigua; chemosensory protein; Western blotting; fluorescence competitive binding assay; molecular dynamics

昆蟲之間以及昆蟲與外界環(huán)境之間聯(lián)系主要靠化學通訊來完成，研究發(fā)現(xiàn)昆蟲觸角感受器中存在幾類在感受外界化學信息過程中起關(guān)鍵作用的蛋白，如氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein， OBP）[1-2]和化學感受蛋白（chemosensory protein， CSP）[3]等。它們與昆蟲尋找寄主、交配產(chǎn)卵、躲避天敵等行為密切相關(guān)[4]。OBP主要結(jié)合和轉(zhuǎn)運揮發(fā)性的化合物，CSP主要結(jié)合和轉(zhuǎn)運非揮發(fā)性的化合物，與OBP相比，CSP的分布和功能更加多樣化[5]，如煙芽夜蛾Heliothis virescens的CSP在足部有較高的表達量[6];東亞飛蝗Locusta migratoria的部分CSP在生殖器中特異表達[7];美洲大蠊Periplaneta americana的PameP10在新生足中的表達量是正常足的30倍，可能參與了足的再生[8];甜菜夜蛾SexiCSP3在雌蟲卵巢中的表達量遠高于其在雄蟲精巢中的表達量，參與調(diào)控產(chǎn)卵行為[9];意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的CSP5在卵中特異表達，影響了幼蟲體壁的發(fā)育[10]等。盡管關(guān)于依據(jù)CSP時空表達分析其生理功能已有大量報道，但目前為止沒有被廣泛認同的假說，一般認為參與化合物的結(jié)合和釋放是其主要功能之一[11]，如東亞飛蝗CSPⅡ與直鏈油酸酰胺特異結(jié)合[12]，甜菜夜蛾SexiCSP3能有效結(jié)合芳香族化合物[13]，甘藍夜蛾Mamestra brassicae的MbraCSPA6與含12～18個碳原子的長鏈脂肪烴類化合物及其鹵代物結(jié)合能力較強[14]，這些研究表明CSP參與了昆蟲對外界化合物的感受和結(jié)合，但仍缺乏更深入的機理研究。

甜菜夜蛾是一種為害糧、棉、蔬菜等多種作物的多食性和間歇性暴發(fā)的重要農(nóng)業(yè)害蟲，特別是在高齡幼蟲階段大量取食葉片，剝食植物莖稈，對作物造成毀滅性的損害[15]，對其嗅覺相關(guān)蛋白功能的研究是探索有效防治方法的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)SexiCSP2基因廣泛分布于嗅覺組織和非嗅覺組織[9]，推測其可能有重要生理功能。本試驗以其為研究對象，采用Western blotting方法檢測其在蛋白水平的表達譜;并以1-NPN為熒光探針，利用純化的重組SexiCSP2蛋白進行熒光競爭結(jié)合試驗，參考Li等[16]和Qiao等[17]的方法，測定其與25種綠色植物揮發(fā)物[18]和蟲害誘導揮發(fā)物[19]的結(jié)合能力;運用分子模擬分析SexiCSP2與氣味分子間的結(jié)合模式和關(guān)鍵氨基酸;為闡明化學感受蛋白作用的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

在相對濕度為70%～80%，室溫26℃，光周期L∥D=14 h∥10 h條件下，在鄭州生物物種資源研究重點實驗室以人工飼料[20]飼養(yǎng)甜菜夜蛾。成蟲以5%的蜂蜜水補充營養(yǎng)。

1.2 主要試劑、材料和儀器

總RNA提取試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，pfu DNA聚合酶，T4連接酶和預染蛋白Marker購自Ferments公司，1-NPN和配基化合物購自Sigma公司，堿性磷酸酶（AP）標記的IgG及相關(guān)試劑購自Amersco公司，熒光光度計型號為Jasco FP-750。分子模擬試驗在河南省涉鳥故障工程技術(shù)研究中心YASARA分子模擬平臺完成。

1.3 引物設(shè)計和cDNA模板的制備

1.3.1 引物設(shè)計

依據(jù)甜菜夜蛾SexiCSP2成熟編碼框序列（EF186794.1）設(shè)計引物，上游引物：5′-AACATATG-

CGGCCCGACGACTCCCACT-3′;下游引物：5′-GCGAATTCAATTCGGAACTAGAAGAACT-3′。引物前兩位為保護堿基，3～8位分別為? NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點。

1.3.2 組織粗蛋白的提取和觸角第一條鏈cDNA的合成

分別取羽化后3 d的雌、雄成蟲觸角、頭、翅、足、胸、腹各約5 mg提取粗蛋白，并提取雄蟲觸角總RNA，并按照試劑盒說明書合成cDNA。

1.4 SexiCSP2基因的克隆和表達

擴增反應(yīng)體系（20 μL）：取1.3.2中合成的雄蟲觸角cDNA約50 ng， 2 μL 10×PCR buffer，1.6 μL dNTP mix，正反引物（10 μmol/L）各1 μL，pfu酶（5 U/μL）0.2 μL，其余為超純水。擴增反應(yīng)程序：95℃預變性4 min;95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán); 72℃延伸10 min，以超純水替代cDNA做陰性對照。

上述擴增產(chǎn)物和載體pET-30b（+）經(jīng)NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，鑒定正確的重組子37℃培養(yǎng)至OD600為0.7，加入IPTG（終濃度為0.4 mmol/L）培養(yǎng)4 h，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達。

1.5 重組蛋白的復性和純化

為確定重組蛋白的表達形式，誘導表達細胞超聲波破碎后經(jīng)12 000 r/min離心沉淀，運用SDS-PAGE電泳法分別檢測上清液和沉淀，若重組SexiCSP2蛋白為包涵體，加入尿素（終濃度8 mol/L）和二硫蘇糖醇（1 mol/L）低溫破碎，于4℃ 12 h透析3次使蛋白復性。重組SexiCSP2蛋白運用離子交換層析（DE-52）和分子篩（Superose-12）法[16]依次純化。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測

試驗共免疫3只新西蘭大白兔，將含200 μg重組蛋白的蛋白溶液與同體積的弗氏完全佐劑混合使其充分乳化后在大白兔背部皮下多點注射，每隔1周用弗氏不完全佐劑替代弗氏完全佐劑乳化蛋白加強免疫1次，共4次，末次免疫7 d后取血，分離血清。

按照AP（堿性磷酸酶）標記的羊抗兔IgG試劑盒說明書方法，以制備的兔多克隆抗體為一抗，AP標記的羊抗兔IgG為二抗，以粗提的各組織蛋白為抗原，檢測SexiCSP2蛋白表達譜。

1.7 熒光競爭結(jié)合試驗

1.7.1 SexiCSP2蛋白與1-NPN結(jié)合常數(shù)的測定

設(shè)定337 nm激發(fā)光波長，掃描發(fā)射光350～500 nm波長范圍，在4 μmol/L SexiCSP2蛋白中加入2～16 μmol/L的1-NPN，反應(yīng)2 min，記錄峰值位置和強度變化。

1.7.2 配體與SexiCSP2蛋白結(jié)合常數(shù)的測定

在4 μmol/L SexiCSP2蛋白中加入8 μmol/L的1-NPN，分別加入不同濃度的外源配體（表1），掃描350～500 nm波長范圍。

1.7.3 數(shù)據(jù)分析

運用GraphPad Prism 5軟件計算蛋白和熒光探針1-NPN的解離常數(shù)K1-NPN值。 假定蛋白中配基的結(jié)合位點數(shù)為1，根據(jù)競爭配基

替換50% l-NPN時的濃度（IC50）和自由 l-NPN濃度（[1-NPN]）計算配基的解離常數(shù)Ki。

Ki=IC50/（1+[1-NPN]）/K1-NPN

1.8 SexiCSP2與氣味分子結(jié)合的分子模擬

1.8.1 SexiCSP2模型和化合物結(jié)構(gòu)的獲取

運用YASARA程序的同源建模模塊構(gòu)建SexiCSP2的三維結(jié)構(gòu)模型，運用ChemBioOffice 10.0軟件構(gòu)建與SexiCSP2結(jié)合能力最強（解離常數(shù)Ki值最?。┑幕衔锏娜S結(jié)構(gòu)模型，并進行能量最小化優(yōu)化。

1.8.2 SexiCSP2與配體的分子對接

以SexiCSP2為受體，結(jié)合能力最強外源化合物為配體，運用YASARA分子模擬軟件進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，包括去H2O、加H質(zhì)子化和添加缺失原子[21];運用AutoDock 4.0進行剛性分子對接，化合物的自由旋轉(zhuǎn)鍵由程序自動識別，對接結(jié)果運用拉馬克遺傳算法，能量匹配通過半經(jīng)驗自由能的計算方法進行評價[22]。

1.8.3 分子動力學模擬

運用YASARA平臺md_run.mcr程序包進行分子動力學模擬，SexiCSP2和小分子的對接復合物溶于TIP3P顯性H2O模型中，設(shè)為周期性邊界條件，溶質(zhì)與模型邊界的最小距離為7 ，體系中添加0.9%的 Cl-平衡多余的正電荷。模擬在pH 7.4和298 K和1個大氣壓條件下進行，采用NVT正則系綜，SHAKE算法[23]限制H原子鍵的收縮，積分步長為2 fs， 采樣間隔為50 ps，均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值達到平衡狀態(tài)后繼續(xù)運行不少于5 ns。

1.8.4 結(jié)合自由能計算和殘基能量分解

采用MM-PBSA（molecular mechanics-Poisson-Boltzmann surface area）方法[24]計算溶液環(huán)境下配體和蛋白的結(jié)合自由能。能量值進一步細分為4項，公式如下：

ΔG=ΔEele+ΔEvdw+ΔGpb+ΔGnopolar

公式中ΔG為結(jié)合自由能，ΔEele為靜電作用力，ΔEvdw為范德華力，ΔGpb為極性溶劑化能，ΔGnopolar為非極性溶劑化能。

2 結(jié)果與分析

2.1 SexiCSP2基因的原核表達和重組蛋白的純化

反轉(zhuǎn)錄RT-PCR方法擴增出SexiCSP2基因，并成功構(gòu)建pET-30b-SexiCSP2重組子，經(jīng)測序驗證：SexiCSP2基因序列與GenBank公布的序列一致，并與pET-30b正確連接。

如圖1所示：IPTG誘導重組子pET-30b-SexiCSP2表達后，在約14 kD處生成一條特異性條帶，誘導的空載體pET-30b（+）和未經(jīng)誘導的pET-30b-SexiCSP2無此條帶，說明SexiCSP2基因在細菌中得到了正確表達。

大量表達pET-30b-SexiCSP2，超聲破碎后離心，檢測發(fā)現(xiàn)重組蛋白大部分存在于沉淀中，說明重組蛋白以包涵體的形式存在;在沉淀中加 8 mol/L 尿素和 1 mol/L 二硫蘇糖醇破碎包涵體，純化后得到高純度的重組蛋白，無明顯的雜帶（圖1泳道4）。

2.2 SexiCSP2的Western blotting檢測

檢測SexiCSP2蛋白在成蟲各組織的分布發(fā)現(xiàn)：除雌蟲胸和腹部外，其他部分均有較強的雜交信號，雌雄個體間有一定差異（圖2）。

2.3 熒光競爭結(jié)合試驗

設(shè)置激發(fā)光波長337 nm掃描SexiCSP2蛋白與1-NPN復合物，4 μmol/L SexiCSP2蛋白逐步加入0～12 μmol/L 1-NPN時熒光強度顯著增加（圖3），計算1-NPN的解離常數(shù)為1.78 μmol/L;通過競爭結(jié)合試驗測定配基（表1）與SexiCSP2蛋白的結(jié)合能力，結(jié)果如圖4和表1所示：SexiCSP2與己醛結(jié)合能力最強，解離常數(shù)為1.3 μmol/L，與對甲基苯酚、鄰羥基苯甲醛、間甲基苯酚和苯乙酮結(jié)合能力次之，解離常數(shù)分別11.7，10.8，18 μmol/L和21.2 μmol/L，與苯基乙醇和2-庚酮結(jié)合能力較弱，解離常數(shù)分別42.2 μmol/L和75 μmol/L;其他配基濃度達到200 μmol/L時復合物熒光強度沒有顯著變化。

2.4 分子對接研究

2.4.1 SexiCSP2的同源建模

經(jīng)同源搜索，發(fā)現(xiàn)3個與目的蛋白序列具有較高相似性的模板，故采用多源建模，3個模板登錄號及相似性分別為：1NBV（65%），2JNY（57%），2VGS（54%），Z-score值為0.782，模型經(jīng)動力學優(yōu)化后保存模型。

2.4.2 SexiCSP2與己醛對接結(jié)果

因SexiCSP2的活性位點不明確，與己醛對接中設(shè)置80×87×90的柵格盒子覆蓋SexiCSP2整個空間結(jié)構(gòu)，格點間距為0.375 ，聚類分析后選取柔性強和結(jié)合能量低的構(gòu)型為最優(yōu)結(jié)合模式（圖5），對接結(jié)果表明己醛結(jié)合于SexiCSP2結(jié)合腔的底部，并與Ala58形成一個氫鍵，鍵長為2 。

2.4.3 對接復合物的分子動力學模擬

為驗證對接復合物的穩(wěn)定性，運用分子動力學模擬分析單體和對接復合物中SexiCSP2主鏈原子的均方根偏差（RMSD），由圖6可以看出：在約15 ns時復合物RMSD在3.5 左右波動，表明體系趨于收斂平衡;穩(wěn)定狀態(tài)時單體SexiCSP2的RMSD在5 左右波動，RMSD值高于復合物中SexiCSP2的RMSD值，表明己醛的結(jié)合使SexiCSP2結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，說明分子對接的結(jié)果是可靠的。

2.4.4 結(jié)合自由能的計算和能量分解

基于MM-PBSA方法計算SexiCSP2和己醛結(jié)合自由能為-32.94 kJ/mol（表2）。說明SexiCSP2和己醛的結(jié)合能自發(fā)進行。結(jié)合自由能的分解發(fā)現(xiàn)靜電作用力、范德華力和非極性溶劑化能促進復合物的形成，貢獻值分別為-82.96，-20.47 kJ/mol和-30.43 kJ/mol，其中范德華力貢獻最大;極性溶劑化能抑制兩者的結(jié)合，貢獻值為100.50 kJ/mol;表2中單個能量項的標準偏差（SD）均低于1%，說明結(jié)合自由能的計算值是可靠的。

3 討論

CSPs在昆蟲組織中分布廣泛，但一般在接觸性器官中表達量較高，以利于感受外界化學刺激。如家蠶Bombyx mori的BmCSP1、BmCSP2在足和觸角中的表達量較高[25]，煙芽夜蛾Heliothis virescens的HvirCSP1、HvirCSP2、HvirCSP3在雌、雄成蟲足部有較高的表達量[6];本研究發(fā)現(xiàn)SexiCSP2不僅在接觸性器官中如觸角，足和翅中表達，在腹部和胸部等非接觸器官也有表達，表達模式在雌雄間也存在差異，這與家蠶CSP4的表達模式是相似的[26];說明SexiCSP2不僅有感受外界化學刺激的嗅覺功能，還可能具有非嗅覺的生理功能。

雖然昆蟲CSP對化合物結(jié)合的特異性比OBP弱，但仍有一定的選擇性[27]。CSP分為3個亞類，同一亞類具有相似的結(jié)合特性，CSP1s亞類主要結(jié)合長烷基鏈的脂肪酸類化合物，CSP2s結(jié)合芳香族化合物[28]，且已經(jīng)在意大利蜜蜂[29]，沙漠蝗Schistocerca gregaria[30]等昆蟲中得到證實。本研究也發(fā)現(xiàn)SexiCSP2蛋白不與長鏈的酯和醇類結(jié)合，與芳香族的甲基苯酚類、苯甲醛等有較強的結(jié)合能力，符合CSP2s亞類的特性;但值得注意的是其與己醛的結(jié)合能力比芳香族化合物高一個數(shù)量級，綜合分析我們認為結(jié)合芳香族化合物可能是CSP2s的共性，考慮到CSP在物種內(nèi)的分化高于物種間，每個CSP很可能還有特異結(jié)合的化合物，如本研究中SexiCSP2和己醛，其他CSPs結(jié)合試驗中未發(fā)現(xiàn)特異結(jié)合物可能是由于測試的化合物數(shù)量不夠多;此外，研究發(fā)現(xiàn)己醛對綠豆象Callosobruchus chinensis[31]、槐綠虎天牛Chlorophorus diadema[32]和西藏簇角纓象天牛Cacia cretifera thibetana[33]均有驅(qū)避作用，但蟲害誘導寄主產(chǎn)生的大量揮發(fā)性己醛對巴氏新小綏螨Neoseiulus barkeri[34]和灰茶尺蠖Ectropis grisescens Warren[35]具有強烈的引誘作用，比較這些結(jié)果推測SexiCSP2可能參與了昆蟲識別寄主的生理過程。

解析甘藍夜蛾Mamestra brassicae的MbraCSPA6、沙漠蝗的CSPsg4和家蠶的BmorCSP1等化學感受蛋白晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其近似圓型，配基結(jié)合于由α螺旋組成的疏水腔內(nèi)[36]，本研究中通過分子對接也發(fā)現(xiàn)己醛結(jié)合于SexiCSP2三維結(jié)構(gòu)中由α螺旋形成的底部腔體內(nèi)，H鍵是SexiCSP2與己醛結(jié)合的分子基礎(chǔ)，范德華力是主要驅(qū)動力，但還需經(jīng)生物學試驗進一步驗證。

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（責任編輯：楊明麗）