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        規(guī)?;膛?chǎng)犢牛腹瀉的病原檢測(cè)與分析報(bào)告

        2021-10-12 03:53:40阮繼湘劉文曉李永清
        中國(guó)乳業(yè) 2021年9期
        關(guān)鍵詞:輪狀病毒沙門(mén)氏菌犢牛

        阮繼湘,劉文曉,江 波,許 健,李永清,程 晶*

        1 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司,北京 100070

        2 北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100097

        0 引言

        隨著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的持續(xù)發(fā)展,犢牛腹瀉病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)。引起該病的原因很多,主要分為感染性和非感染性。若沒(méi)有及時(shí)找到病因進(jìn)行有效治療,則會(huì)影響新生犢牛的生長(zhǎng)和繁育,嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)死亡,造成經(jīng)濟(jì)損失。因此,對(duì)患病犢牛做出及時(shí)準(zhǔn)確的診斷和治療,可以保證牛只健康,促進(jìn)養(yǎng)牛業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

        2021年入夏以來(lái),收到內(nèi)蒙古某規(guī)模化奶牛場(chǎng)牛群出現(xiàn)犢牛腹瀉病況的報(bào)告。患病牛涉及1~6 月齡犢牛,牧場(chǎng)256頭犢牛中,20 頭出現(xiàn)腹瀉癥狀。主要癥狀是持續(xù)腹瀉20 多天,糞便呈黃綠色水樣,部分犢牛糞便中帶有血液和黏液。大部分出現(xiàn)脫水和衰弱;體溫38.8~39.3 ℃;聽(tīng)診心跳快,肺部濕羅音,瘤胃處有鋼管音。曾以頭孢嘧啶和恩諾沙星治療,但效果不佳,并出現(xiàn)了3 頭牛死亡,約占發(fā)病牛的15.00%。為查明腹瀉發(fā)生和流行的原因,對(duì)腹瀉犢牛的血液和糞便進(jìn)行細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)的病原學(xué)和核酸檢測(cè),對(duì)腹瀉犢牛血清進(jìn)行病毒抗體檢測(cè)。

        1 材料與方法

        1.1 病料

        對(duì)腹瀉犢牛進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)采樣,采集腹瀉犢牛血液及血清樣品各20 份。直腸糞便采樣,收集水樣糞樣6個(gè),稀便糞樣3 個(gè),共計(jì)9 個(gè)糞樣。

        1.2 血清抗體檢測(cè)

        用牛副結(jié)核、牛病毒性腹瀉/黏膜病酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)檢測(cè)試劑盒(IDEXX公司)分別檢測(cè)牛副結(jié)核分枝桿菌抗體以及牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒抗體,具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;同時(shí)以病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)牛輪狀病毒和冠狀病毒抗體。

        1.3 細(xì)菌分離鑒定

        選擇腹瀉癥狀嚴(yán)重的病牛直腸糞便,以Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基(一種專(zhuān)門(mén)用于空腸彎曲桿菌、霍亂弧菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌等腸道致病菌標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和短期保存的培養(yǎng)基)保存運(yùn)輸。取少量樣品直接劃線(xiàn)接種于麥康凱平板用于大腸桿菌的分離;進(jìn)而利用沙門(mén)氏菌專(zhuān)用亞硒酸鹽胱氨酸增菌液進(jìn)行37.0 ℃過(guò)夜培養(yǎng),增菌液劃線(xiàn)接種于沙門(mén)氏菌顯色鑒別培養(yǎng)瓊脂平板,用于沙門(mén)氏菌的分離培養(yǎng);最后利用Bolton肉湯于微需氧產(chǎn)氣袋的厭氧罐中37.0 ℃過(guò)夜培養(yǎng),將增菌液劃線(xiàn)接種于彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基(CCDA平板),于37.0 ℃厭氧罐中培養(yǎng)48 h。挑取生長(zhǎng)一致的單個(gè)菌落涂片鏡檢并進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定。

        彎曲菌三重PCR鑒定:取疑似彎曲菌培養(yǎng)菌液0.5 mL,離心后去除上清液,菌沉淀加入50.0 μL純水重懸,煮沸5 min,離心后取上清液用于三重PCR檢測(cè)。三重PCR檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行,即同時(shí)擴(kuò)增彎曲菌屬16S rRNA基因(857 bp)、空腸彎曲菌mapA基因(589 bp)和結(jié)腸彎曲菌ceuE基因(462 bp)。

        1.4 寄生蟲(chóng)卵檢測(cè)

        取腹瀉犢牛糞便約10.0 g,加飽和食鹽水100.0 mL混勻,通過(guò)60 目銅網(wǎng)過(guò)濾于小燒杯中,立即吸取濾液至小青瓶中形成凸面,靜置30 min后,以清潔載玻片輕觸液面于顯微鏡下檢查蟲(chóng)卵[3]。

        1.5 病毒檢測(cè)

        分別取磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的糞便上清以及血液樣品200.0 μL,使用病毒/細(xì)菌核酸柱式提取試劑盒提取樣品核酸(北京森康生物技術(shù)有限公司)。使用牛病毒性腹瀉熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒(北京森康生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒。將提取的樣品核酸反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行輪狀病毒VP6基因以及牛冠狀病毒N基因PCR擴(kuò)增,檢測(cè)引物[生物工程(上海)股份有限公司合成]見(jiàn)表1[2]。25.0 μL PCR反應(yīng)體系如下:2×T5 Super PCR Mix 12.5 μL,上下游引物各1.5 μL,擴(kuò)增樣本cDNA/DNA 2.0 μL,ddH2O 7.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為:94.0 ℃,2 min;94.0 ℃,30 s;55.0 ℃,30 s;68.0 ℃,40 s;68.0 ℃,5 min,40 個(gè)循環(huán)。取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠核酸電泳后,用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

        表1 檢測(cè)牛冠狀病毒及輪狀病毒的引物序列

        2 結(jié)果

        2.1 血清抗體檢測(cè)

        對(duì)所采集的20 份腹瀉犢牛血清進(jìn)行腹瀉相關(guān)病原的ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明,所有樣品的牛副結(jié)核桿菌抗體均為陰性,牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒抗體陽(yáng)性率為65.00%;病毒中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,牛輪狀病毒抗體陽(yáng)性率25.00%,而牛冠狀病毒抗體15.00%。

        2.2 致病性細(xì)菌分離鑒定

        對(duì)收集的9 份牛直腸糞便,進(jìn)行不同菌落的形態(tài)觀(guān)察、生化試驗(yàn)以及16sRNA PCR鑒定。PCR結(jié)果未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌和腸炎沙門(mén)氏菌等與下痢相關(guān)的致病菌株,但41號(hào)及57號(hào)牛直腸糞便樣品在彎曲菌選擇培養(yǎng)基CCDA上生長(zhǎng)菌落,經(jīng)彎曲菌三重PCR鑒定,其中1 株為結(jié)腸彎曲桿菌,另1 株為空腸彎曲桿菌(圖1)。

        圖1 牛彎曲菌三重PCR 鑒定結(jié)果

        2.3 寄生蟲(chóng)卵檢測(cè)

        對(duì)收集的9 份牛直腸糞便進(jìn)行鏡檢,7 份糞樣中發(fā)現(xiàn)球蟲(chóng)卵囊,球蟲(chóng)卵囊檢出率達(dá)77.78%。同時(shí),含有球蟲(chóng)卵囊的糞樣中,有1 份糞樣發(fā)現(xiàn)蛔蟲(chóng)卵,2份糞樣發(fā)現(xiàn)其他線(xiàn)蟲(chóng)卵。

        2.4 病毒檢測(cè)

        針對(duì)牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、輪狀病毒以及冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的檢測(cè)結(jié)果表明,在20份牛血液和9 份糞便樣品中,57號(hào)牛血液及糞便樣品為牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性,糞便樣品中牛冠狀病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性;此外,9號(hào)牛的糞便中檢測(cè)到牛冠狀病毒;28號(hào)牛的糞便樣品同時(shí)檢測(cè)到輪狀病毒和牛冠狀病毒;41號(hào)牛的血液樣品中檢測(cè)到牛冠狀病毒,糞便樣品中含有牛輪狀病毒;55號(hào)牛的糞便樣品中則含有牛冠狀病毒(圖2)。

        圖1 牛彎曲菌三重PCR 鑒定結(jié)果

        3 分析與討論

        犢牛腹瀉是規(guī)模化奶牛場(chǎng)常見(jiàn)的一種消化系統(tǒng)疾病,一年四季均可發(fā)生。主要表現(xiàn)為急性或慢性下痢,不僅使奶牛的抵抗力變差,生長(zhǎng)緩慢甚至引起死亡。調(diào)查資料表明,規(guī)模化奶牛場(chǎng)的犢牛腹瀉在斷奶前后的患病率和發(fā)病率通常分別為3.0%和0.5%,而本次牛場(chǎng)暴發(fā)的犢牛腹瀉率為7.81%,遠(yuǎn)高于目前的平均發(fā)病率。

        該病在不同時(shí)期存在不同的病因,一般可以分為營(yíng)養(yǎng)性腹瀉和傳染性腹瀉。營(yíng)養(yǎng)性腹瀉是由于營(yíng)養(yǎng)因素和飼養(yǎng)管理不當(dāng)而造成的消化不良,可以通過(guò)改變喂飼方式而改善;但傳染性腹瀉的致病因素比較復(fù)雜,包括牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、冠狀病毒、輪狀病毒等病毒,也可能因腸炎沙門(mén)氏菌、產(chǎn)毒型大腸桿菌、空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲菌引起。從實(shí)驗(yàn)室收集的病料檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,未發(fā)現(xiàn)腸炎沙門(mén)氏菌以及產(chǎn)毒型大腸桿菌,可能與病牛接受了抗菌藥物治療有關(guān)。但牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒,空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲菌,牛球蟲(chóng)等病原感染嚴(yán)重,尤其是與腹瀉相關(guān)的病毒,如牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀腹瀉病毒等,不僅存在于腹瀉犢牛的糞便中,甚至引發(fā)了病毒血癥,因此,多病原同時(shí)感染或繼發(fā)感染是規(guī)?;膛?chǎng)流行性犢牛腹瀉的主要因素。

        這些病原體的感染和致病與氣候潮濕、多雨造成牛場(chǎng)污穢的環(huán)境密切相關(guān)。夏季正是奶牛腹瀉的高發(fā)和流行時(shí)期,奶牛場(chǎng)需要對(duì)該病高度重視。一是確保牛舍干凈的環(huán)境衛(wèi)生和通風(fēng)條件,并采取嚴(yán)格消毒等綜合防控措施;二是定期對(duì)全群牛進(jìn)行血清學(xué)檢查,及時(shí)掌握病毒在牛群中的流行狀況,發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性牛,要堅(jiān)決隔離、淘汰,以防疫情擴(kuò)大;三是要做好牛只的定期驅(qū)蟲(chóng)工作,以免球蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)感染破壞牛腸上皮細(xì)胞造成繼發(fā)感染。

        治療腹瀉,補(bǔ)液是關(guān)鍵。腹瀉發(fā)生時(shí)即灌服畜禽專(zhuān)用營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)液鹽,能有效緩解腹瀉牛出現(xiàn)脫水、電解質(zhì)失衡和酸中毒等,同時(shí)應(yīng)該根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,使用敏感抗生素進(jìn)行治療。針對(duì)此次疫情中分離的牛彎曲菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn),篩選到具有高度抑菌作用的馬坡沙星等喹諾酮藥物,治療效果明顯。目前,我國(guó)已有牛病毒性腹瀉/黏膜病滅活疫苗上市,建議對(duì)感染嚴(yán)重的牛群實(shí)施預(yù)防接種。

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