石雪萍，余 芳，胡紫瓊

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 健康學(xué)院，江蘇 南京 211168)

青蒿素(Artemisinin)是從復(fù)合花序植物黃花蒿葉中提取得到的一種無(wú)色針狀晶體。青蒿素是繼乙氨嘧啶、氯喹、伯氨喹之后最有效的抗瘧特效藥，世界衛(wèi)生組織稱(chēng)之為“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”。青蒿素主要用于治療瘧疾，除此以外，許多文獻(xiàn)還報(bào)道其具有抗炎、抗膿毒癥、抗腫瘤、放療增敏、抗菌增敏、抗組織纖維化以及治療其他寄生蟲(chóng)病等作用。青蒿素的測(cè)定有碘量法、薄層掃描等方法。

馬蘭，菊科馬蘭屬植物，又稱(chēng)馬蘭頭、雞兒腸、馬菜、田邊菊等。馬蘭屬于野生生長(zhǎng)的植物，在田野、路邊、山坡上都有分布。現(xiàn)如今人工栽培的馬蘭在市場(chǎng)上普遍可見(jiàn)，其營(yíng)養(yǎng)成分與野生馬蘭會(huì)有些許差別。但不管是野生的還是種植的馬蘭，經(jīng)常食用都會(huì)有一定的保健作用。

馬蘭與青蒿同屬菊科植物，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明馬蘭含有青蒿素的成分。本研究采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC)測(cè)定馬蘭中青蒿素的含量，并檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

青蒿素對(duì)照品(南京森貝咖生物科技有限公司，純度≥98%)，甲醇(色譜純)，0.2%NaOH，乙醇，石油醚(30～60 ℃)，蒸餾水。

1.1.2 儀器設(shè)備

電子不銹鋼水浴鍋：鄭州市亞榮儀器有限公司；電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；安捷倫1200高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；SZF-06A粗脂肪測(cè)定儀(索氏抽提器)：上海洪紀(jì)儀器有限公司。

其他：定性濾紙(15 cm×8 cm),脫脂棉,容量瓶(50、100、250 mL),移液管(1、2、5、10 mL),洗耳球,洗瓶,燒杯,100 mL量筒,離心管。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 索氏提取法提取馬蘭中的青蒿素

取一張大小適宜的長(zhǎng)方形定性濾紙，將其卷成直徑約2 cm的圓筒，將濾紙筒的一端折到筒中，制成圓筒的底部，取少許脫脂棉放入筒內(nèi)，用脫脂棉細(xì)線扎起來(lái)。

將馬蘭試樣用粉碎機(jī)粉碎(不用太碎)，稱(chēng)取2.0 g于濾紙筒內(nèi)，在馬蘭試樣上放上一層脫脂棉，并將濾紙筒的頂端紙邊折入筒內(nèi)，使整個(gè)濾紙筒高約4 cm。

搭好索氏提取器，水管是下進(jìn)上出。將濾紙筒裝入索氏提取器，連接用無(wú)水乙醇洗滌過(guò)并烘干的平底燒，安裝冷凝器，裝好后在其上口放一漏斗，將100 mL石油醚經(jīng)過(guò)漏斗轉(zhuǎn)移到抽提器中。在(50±1) ℃的水浴鍋中恒溫加熱，經(jīng)過(guò)8次回流虹吸，提取時(shí)間為2 h，停止加熱。取下冷凝器，將平底燒瓶?jī)?nèi)的提取液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶并用石油醚定容，再轉(zhuǎn)移至100 mL試劑瓶中，貼上標(biāo)簽。

1.2.2 HPLC法測(cè)定馬蘭中青蒿素的含量

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(75∶25)；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃。

1.2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取馬蘭供試品溶液，以轉(zhuǎn)速13000 r·min-1離心3 min，按上述1.2.2.1色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。理論板數(shù)以青蒿素峰計(jì)算不應(yīng)高于4500，色譜峰對(duì)稱(chēng)因子均在0.95～1.05，青蒿素峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將0.1 mg·mL-1的青蒿素對(duì)照品溶液通過(guò)0.45 μL的膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，放入儀器，分別以5、10、15、20 μL 的進(jìn)樣量進(jìn)樣。根據(jù)所測(cè)得的色譜峰，記錄色譜峰的出峰時(shí)間和峰面積。青蒿素對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 青蒿素對(duì)照品色譜

以青蒿素進(jìn)樣量(y)對(duì)峰面積值(x)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=9.1756x+14.964。結(jié)果表明，青蒿素的進(jìn)樣量在0～20 μL，與峰面積呈良好線性關(guān)系。青蒿素液相標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 青蒿素液相標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2.4 精密度試驗(yàn)

取濃度為0.1 mg·mL-1的青蒿素對(duì)照品溶液，用0.45 μL的膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量為20 μL，分別記錄色譜峰的出峰時(shí)間和峰面積，根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算一日內(nèi)精密度；以同樣步驟連續(xù)進(jìn)樣5 d，記錄出峰時(shí)間和峰面積，根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度的RSD=0.95%，日間精密度的RSD=0.96%，表明該儀器的精密度良好。

1.2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別吸取濃度為0.1、0.2、0.3 mg·mL-1的青蒿素對(duì)照品溶液，用0.45 μL的膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，于0、3、6、9、12 h分別進(jìn)樣，記錄出峰時(shí)間和峰面積。結(jié)果顯示，RSD分別為0.63%、0.50%和0.55%，表明對(duì)照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.2.6 加樣回收率試驗(yàn)

將青蒿素標(biāo)準(zhǔn)溶液和馬蘭供試品溶液分別以1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5的比例混合，并用0.45 μL的膜過(guò)濾，分別加入五個(gè)進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣量都為20 μL。以上述進(jìn)樣條件進(jìn)行測(cè)定，記錄相應(yīng)的出峰時(shí)間和峰面積。根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算青蒿素的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率

2 青蒿素含量測(cè)定

取馬蘭供試品溶液通過(guò)0.45 μL的膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，并放入HPLC儀器內(nèi)，進(jìn)樣量為40 μL，以上述進(jìn)樣條件進(jìn)行測(cè)定，記錄出峰時(shí)間和峰面積，測(cè)定樣品馬蘭中青蒿素的含量。計(jì)算3次測(cè)定結(jié)果的平均值，馬蘭中青蒿素的含量為0.285 mg/g。馬蘭樣品色譜圖見(jiàn)圖3，青蒿素含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 馬蘭樣品色譜

表2 HPLC法測(cè)定青蒿素含量

3 結(jié)論

HPLC法是經(jīng)分離后測(cè)定的一種方法，將青蒿素類(lèi)似物分離，排除了干擾，可以更有效地對(duì)青蒿素進(jìn)行測(cè)定。這種方法的精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率的試驗(yàn)結(jié)果均較好，適用于馬蘭中青蒿素含量的測(cè)定。