◎ 康雪梅，陶 燕，郭倩倩，李 新，李夢雨，賈松濤，趙雪峰，趙林萍

（河南中標檢測服務有限公司，河南 鄭州 450001）

咖啡因是一種黃嘌呤生物堿化合物，是一種中樞神經(jīng)興奮劑，能夠暫時驅(qū)走睡意并恢復精力，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱和昏迷復蘇。有咖啡因成分的咖啡、茶、軟飲料及能量飲料十分暢銷，因此，咖啡因也是世界上最普遍被使用的精神藥品。過多的飲用攝入大量的咖啡因，導致作息不規(guī)律引發(fā)精神紊亂；還會引起腸痙攣。長期飲用會引發(fā)慢性胃炎，刺激腎功能，導致兒童多尿，流失大量鈣質(zhì)，影響骨骼發(fā)育。2017年10月27日，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單初步整理參考，咖啡因?qū)儆?類致癌物，即“尚不能分類”的致癌物[1]。

目前，咖啡因檢測方法主要有碘量法、HPLC法、近紅外光譜分析法、毛細管電泳法等。近幾年對于液質(zhì)法的使用逐漸增多，但基本也是外標法的建立使用[2-7]。外標法對于復雜基質(zhì)的測定難于避免基質(zhì)效應等部分的影響。因此本文旨在建立同位素內(nèi)標-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定飲料中咖啡因含量的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

碳酸飲料（可樂）、功能型飲料（紅牛）、綠茶、咖啡等。

1.2 試劑及儀器設備

甲醇（色譜純，美國賽默飛）；乙腈（色譜純，美國賽默飛）；甲酸（色譜純，美國賽默飛）；咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ朑138494，純度98.8%，美國DR）；咖啡因-D3同位素內(nèi)標對照品（批號449472，100 mg·L-1，o2si）；試驗用水為去離子水。

TSQ vanquish超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技）；天平，感量為0.1 mg（美國奧豪斯）；水浴鍋；超聲波清洗器，0.45 μm微孔水相濾膜（津騰）。

1.3 試驗方法

1.3.1 對照品溶液的制備

（1）咖啡因標準儲備液（1 mg·mL-1）。準確稱取咖啡因標準品10 mg（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，4 ℃冰箱保存。

（2）咖啡因標準中間工作液（1 μg·mL-1）。準確吸取0.1 mL咖啡因標準儲備液于100 mL容量瓶中用水定容后，4 ℃冰箱保存。

（3）咖啡因-D3同位素內(nèi)標標準中間工作液（1 μg·mL-1）。準確吸取1 mL咖啡因標準儲備液于100 mL容量瓶中用水定容后，4 ℃冰箱保存。

（4）咖啡因標準曲線工作液。分別吸取咖啡因標準中間液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL和2.00 mL于10 mL容量瓶中，向其中分別加入0.1 mL咖啡因-D3同位素內(nèi)標標準中間工作液，用水定容，得到咖啡因濃度分別為5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1，內(nèi)標濃度為10 ng·mL-1，臨用時配制。

1.3.2 樣品的制備凈化過程

（1）可樂型飲料。①脫氣。樣品用超聲清洗器在40 ℃下超聲5 min。②凈化。稱取5 g（精確至0.001 g）樣品，加入咖啡因內(nèi)標標準中間工作液（1 μg·mL-1）100 μL，加水定容至100 mL，搖勻，加入0.5 g氧化鎂，振搖，靜置，取上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，備用。

（2）不含乳的咖啡及茶葉液體制品。稱取5 g（精確至0.001 g）樣品，加水定容至100 mL，搖勻，加入0.5 g氧化鎂，振搖，靜置，取上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，備用。

（3）含乳的咖啡及茶葉液體制品。稱取1 g（精確至0.001 g）樣品，加入三氯乙酸溶液（10 g·L-1）定容至100 mL，搖勻，靜置，沉降蛋白，取上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，備用。

若樣品溶液中咖啡因含量超出標準曲線范圍需再做稀釋，相應內(nèi)標加入量要增加，使內(nèi)標上機濃度為10.0ng·mL-1。

1.3.3 儀器條件

（1）色 譜 條 件。色 譜 柱，waters ACQUITY UPLC BEH C18，粒徑1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流動相：0.1%甲醇+0.1%甲酸水；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量，2 μL。

（2）質(zhì)譜條件。離子源溫度：350 ℃；離子化方式：ESI+源；多反應監(jiān)測模式。

1.3.4 標準曲線的制作

將標準系列工作液分別注入液相色譜儀中，測定相應的峰面積，以標準工作液的濃度為橫坐標，以咖啡因和咖啡因-D3峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.5 試樣溶液的測定

將試樣溶液注入液相色譜儀中，以保留時間定性，以保留時間及離子峰度比雙重定性，以咖啡因和咖啡因-D3峰面積比值帶入標準曲線定量。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

采用不經(jīng)液相，直接手動和自動注射的方式，在正、負模式下切換，選擇合適的電離模式，結果顯示咖啡因在正離子模式下?lián)碛休^好的響應度。然后在正離子模式下對咖啡因及咖啡因-D3進行Q1母離子及Q3子離子進行優(yōu)化，選取1個母離子和2個最優(yōu)子離子，并分別得到碰撞能，確定定性離子對和定量離子對，結果見表1?？Х纫蚣翱Х纫駾3的總離子流圖和提取離子色譜圖、棒狀圖見圖1、圖2和圖3。

圖1 飲料中咖啡因和咖啡因-D3經(jīng)LC/MSMS分析得到的總離子流圖

圖2 飲料中咖啡因和咖啡因-D3經(jīng)LC/MSMS分析得到的提取離子色譜圖

圖3 飲料中咖啡因和咖啡因-D3經(jīng)LC/MSMS分析得到的提取離子棒狀圖

表1 咖啡因和咖啡因-D3的質(zhì)譜多反應監(jiān)測檢測條件表

2.2 線性范圍、檢出限與定量限研究

用試劑分別配制濃度為0.1 ng·mL-1、 0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1L、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1、200.0 ng·mL-1、500.0 ng·mL-1、1 000.0 ng·mL-1、2 000.0 ng·mL-1的咖啡因標準溶液，在上述質(zhì)譜條件下測定，以濃度和峰面積繪制標準曲線。結果表明，在0.2～500.0 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，飲料中咖啡因有較高的線性擬合度，以SN＞3時標線的濃度對應樣品的濃度為檢出限，以SN＞10時標線的濃度對應樣品的濃度為定量限。本法咖啡因的檢出限為0.2 ng·mL-1（相當于1 g樣品定容體積為100 mL時，檢出限為20 ng·mL-1）；定量限為0.5 ng·mL-1（相當于1 g樣品定容體積為100 mL時，定量限為50 ng·mL-1）。

2.3 回收率、方法重復性研究

由于市售綠茶、紅牛、咖啡等飲料咖啡因含量不均，且濃度較高，添加低濃度的咖啡因研究其回收率重復性無法獲取準確結果，因此本試驗將咖啡因-D3標準物質(zhì)添加到可樂、綠茶、紅牛、咖啡中，添加濃度水平為20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、200 ng·mL-1的質(zhì)控濃度溶液，平行試驗10次，計算加標回收率和精密度，結果見表2。由表2可知，待測物的回收率均大于84.3%，精密度均小于12.0%。

表2 方法的精密度和加標回收率表（n=10）

2.4 實際樣品的檢測

采用本方法對市售的紅茶、綠茶、咖啡、可樂、茶飲料等20個市售飲品進行測定。結果顯示，咖啡因均有檢出，含量在50～2 000 μg·mL-1，這說明市售的未標明咖啡因含量的飲料也或多或少含有一定量的咖啡因，對于兒童等不易食用咖啡因的人群來說是潛在的隱患。

3 結論

本試驗基于LC-MS/MS同位素內(nèi)標法建立了市售飲料中咖啡因的快速定性定量分析方法。該方法簡單易行，分析時間短，靈敏度高，重復型好，不僅能夠滿足日常實際檢測要求，對于痕量樣品的分析同樣適用。