◎ 賽 平，崔瑞霞，宋潤娜，趙喜華

（河南中測技術(shù)檢測服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450000）

芝麻醬[1]是由芝麻經(jīng)加工而成，若保存不當(dāng)，很容易導(dǎo)致芝麻醬的各項(xiàng)指標(biāo)不合格。芝麻醬是人們非常喜愛的一種食物[2]，也被列在我國食品安全監(jiān)督抽檢范圍內(nèi)，在實(shí)際抽檢過程中，多次發(fā)現(xiàn)芝麻醬存在黃曲霉毒素B1檢出甚至超標(biāo)現(xiàn)象。黃曲霉毒素[3]具有非常強(qiáng)的致癌性，其毒性是砒霜的68倍。GB 2761—2017[4]制 定 了 黃 曲 霉 毒 素B1（Aflatoxin B1，AFTB1）的限量標(biāo)準(zhǔn)[4]，其中規(guī)定芝麻醬中黃曲霉毒素B1的限量為≤5.0 μg·kg-1。

黃曲霉毒素B1是黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)、危害最大的一種，長期少量食用后有可能導(dǎo)致肝功能受損，甚至引起肝癌。目前常用的檢測方法有高效液相色譜柱后電化學(xué)衍生法[5]、高效液相色譜柱后碘試劑衍生法[6]、高效液相色譜柱后光化學(xué)衍生法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]、高效液相色譜柱前衍生法[9-10]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS-MS）[10-11]等，其中高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS-MS）選用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)試劑一般較為昂貴，日常檢測成本較高，柱前衍生法前處理過程中的待測組分損失較多，因此實(shí)驗(yàn)室多采用柱后衍生法，此方法適合大批量的日常監(jiān)督抽檢樣品的檢測。本研究通過QuEChERS凈化法，采用高效液相色譜法-碘柱后衍生-熒光檢測器法檢測芝麻醬中黃曲霉毒素B1的含量，發(fā)現(xiàn)此方法操作簡單、快速、準(zhǔn)確，且靈敏度高，為芝麻醬中黃曲霉毒素B1的含量的測定提供了有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻醬20批次，采購于河南省各超市和農(nóng)貿(mào)市場。

乙腈（色譜純），美國Fisher公司；氯化鈉（分析純），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；磷酸氫二鈉（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；免疫親和柱，柱容量300 ng；黃曲霉毒素B1，德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇，美國Fisher公司；異丙醇，美國Fisher公司；碘試劑（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；0.22 μm濾膜，天津津騰；黃曲霉毒素B1免疫親和柱，安捷倫科技。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儀器與設(shè)備

Waters E2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；waters衍生化系統(tǒng)，Waters Symmetry Shield TM RP18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；數(shù)控超聲波提取器（KH-500DB），昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；電子天平（FA2004），上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)（TG-16），四川蜀科儀器有限公司；氮吹儀（MAI-DCY-24Y），上海那艾精密儀器有限公司。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制黃曲霉毒素B1（C17H12O6，CAS號：1162-65-8 TMstandard）標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 ng·mL-1）：準(zhǔn)確移取500 μL黃曲霉毒素B1（2 μg·mL-1），溶解于甲醇溶液并用容量瓶定容至10 mL，存放于-20 ℃冰箱中。吸取適量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用初始流動相定容至刻度，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用時(shí)配制。

1.2.3 樣品處理

稱5 g樣品于含有凈化劑包Quechers（含0.6 g硫酸鎂，0.1 g PSA）試管中，加4 mL水、10 mL甲醇和QuEChERS提取劑（0.4 g硫酸鎂、0.1 g氯化鈉、0.1 g檸檬酸鈉、0.05 g檸檬酸二鈉），渦旋1 min后，超聲蕩震20 min，10 000 r·min-1高速離心5 min，上清液過濾膜，待測。

1.2.4 色譜條件

流動相A：水，流動相B：乙腈∶甲醇（50∶50）；等度洗脫：流動相A，68%，流動相B，32%；色譜柱：C18柱（柱長150 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生溶液流速：0.2 mL·min-1；衍生反應(yīng)管溫度：70 ℃；激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

采用Waters Symmetry Shield TM RP18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Waters XBridge C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Welchrom HPLC colum C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）4種色譜柱在相同條件下對相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，檢測分析效果和保留時(shí)間。結(jié)果顯示，Waters Symmetry Shield TM RP18（4.6×150 mm，5 μm）色譜柱分離效果好，故選用該色譜柱。

2.1.2 流動相的優(yōu)化

為提高目標(biāo)分析物的分離效果和響應(yīng)水平，實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈甲醇（1∶1）-水等流動相體系，結(jié)果顯示采用乙腈甲醇（1∶1）-水檢測黃曲霉毒素B1目標(biāo)物的分離度和響應(yīng)值最優(yōu)，因此選用乙腈甲醇（1∶1）-水，通過改變流動相比例，達(dá)到較好的分離效果。濃度為5.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見圖1。

圖1 5.0 ng·mL-1黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 凈化方法的優(yōu)化

芝麻醬中黃曲霉毒素B1的提取溶劑中，比較常見的有乙酸乙酯[5-7]、乙腈[8,11]、鹽溶液[12-13]等。由于芝麻醬含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪及多種維生素和礦物質(zhì)，因此需要加入0.6 g硫酸鎂和0.1 g PSA進(jìn)行初次凈化，提高相關(guān)藥物的回收率[14-15]。本研究比較了添加0.1 g硫酸鎂和0.1 g PSA、0.3 g硫酸鎂和0.1 g PSA、0.6 g硫酸鎂和0.1 g PSA、0.6 g硫酸鎂和0.15 g PSA、0.6 g硫酸鎂和0.2 g PSA 5種組合的提取效果，通過比對分析發(fā)現(xiàn)0.6 g硫酸鎂和0.1 g PSA回收率最優(yōu)，故選擇其為凈化方法。

2.3 檢驗(yàn)方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

在0.5～100.0 μg·kg-1濃度范圍內(nèi)，配置標(biāo)液濃度為0.1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、3.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、30.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行檢測，用外標(biāo)法定量，以目標(biāo)化合物的定量峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系相關(guān)系數(shù)R=0.999 7。采用溶劑稀釋的方法，分別以3倍和10倍信噪比確定方法檢出限（Limits of Detection，LOD）和定量限（Limits of Quantification，LOQ），檢出限為0.1 μg·kg-1，定量限為0.3 μg·kg-1，按樣品取樣量為5.0 g計(jì)算，檢出濃度下限為0.1 μg·kg-1，定量濃度下限為0.3 μg·kg-1，與國標(biāo)方法[10]相關(guān)文獻(xiàn)檢測方法結(jié)果接近[12-15]。

2.4 檢驗(yàn)方法的回收率和精密度

本方法采用加標(biāo)回收試驗(yàn)來驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和可行性，在空白芝麻醬樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液制得1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13個(gè)水平的加標(biāo)樣品，每個(gè)水平連續(xù)重復(fù)6次，按所述進(jìn)行樣品處理和結(jié)果分析，數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1 3批不同廠家的芝麻醬加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

從結(jié)果中得出，各化合物的平均回收率為83.2%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～8.7%，方法的準(zhǔn)確性和精密度滿足GB/T 27404—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測質(zhì)量控制要求[16]。

2.5 實(shí)際樣品的測定

采樣本監(jiān)測方法對20批芝麻醬（采購于河南省各超市和農(nóng)貿(mào)市場）進(jìn)行檢測。通過對實(shí)際樣品的檢測結(jié)果分析，其中11批芝麻醬檢出濃度在3.54～26.9 μg·kg-1范圍內(nèi)，存在一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.22—2016、SN/T 3136—2012、SN/T 3263—2012和SN/T 4921—2017等國標(biāo)和進(jìn)出口標(biāo)準(zhǔn)方法對檢出樣品進(jìn)行復(fù)測，對比發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與本方法結(jié)果相對偏差小于8.7%，表明此檢測方法可靠、準(zhǔn)確，并且該檢測方法存在效率高、成本低的優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

本研究對QuEChERS凈化法測定芝麻醬中AFB1的方法進(jìn)行了優(yōu)化，通過實(shí)驗(yàn)得知其加標(biāo)回收率、精密度都能達(dá)到GB 5009.22—2016的標(biāo)準(zhǔn)要求。QuEChERS凈化法極具優(yōu)勢，有機(jī)試劑使用量節(jié)約50%以上，同時(shí)不用免疫親和柱，經(jīng)濟(jì)效益至少提高50%。經(jīng)驗(yàn)證該方法回收率和重現(xiàn)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠[14]，適用于大規(guī)模測定芝麻醬中黃曲霉毒素B1[15]，是一種比較值得推廣的方法。

在一定的濕度和溫度條件下，黃曲霉極易引起食品霉變產(chǎn)生毒素，對人體健康造成威脅。因此，加強(qiáng)對食品中黃曲霉毒素B1快速高效的檢測研究十分必要，其中樣本前處理方面的研究是提高檢測效率的關(guān)鍵點(diǎn)。