杜淑霞 單 旺 徐 麗 滕曉煥 譚奇坤

(1. 廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕化工技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；2. 南海油脂工業(yè)〔赤灣〕有限公司，廣東 深圳 518000；3. 暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632)

四氫姜黃素是姜科植物姜黃根莖中分離出的姜黃素的氫化衍生物，無(wú)色無(wú)臭，因其良好的抗氧化、抗腫瘤和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用和安全性，在食品工業(yè)中被用作食品添加劑，在制藥工業(yè)中可作為新型的醫(yī)藥原料和中間體。

目前國(guó)內(nèi)外主要應(yīng)用姜黃素通過(guò)化學(xué)法或微生物法制備四氫姜黃素[1-2]，但姜黃素需從植物中提取，成本較高，而以大宗化工中間體香蘭素作為起始原料成本相對(duì)較低，但未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。在活性研究方面，目前在綜合評(píng)價(jià)四氫姜黃素體外抗氧化能力、探討其在油脂中的抗氧化能力等方面也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

試驗(yàn)擬以香蘭素、乙酰丙酮為起始原料，經(jīng)克萊森縮合反應(yīng)、氫化反應(yīng)合成四氫姜黃素，采用紫外—可見(jiàn)分光光度(UV-VIS)、紅外光譜(IR)、核磁共振波譜(1H-NMR，13C-NMR)等方法對(duì)四氫姜黃素的純度和結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，從清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、總抗氧化能力、鐵離子還原能力、金屬離子鰲合能力方面，對(duì)四氫姜黃素的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)試，并采用GB/T 21121—2007動(dòng)植物油脂加速氧化測(cè)試法測(cè)定了其在花生油、芝麻油、豬油等油脂中的抗氧化能力，并與常見(jiàn)抗氧化劑二丁基羥基甲苯(BHT)和維生素C(VC)進(jìn)行對(duì)比。旨在探索四氫姜黃素的更有效的制備方法，為其更好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

香蘭素、乙酰丙酮、三氧化二硼、硼酸三丁酯、三乙胺、DPPH、ABTS 、三吡啶三嗪(TPTZ)、氘代氯仿、過(guò)硫酸鉀、磷酸鈉、四水合鉬酸銨、氯化鐵、氯化亞鐵、菲啰嗪：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

鈀碳：分析純，廣州蘇喏化工有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水硫酸鈉、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、鹽酸、硫酸、冰乙酸：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

四氫姜黃素(純度≥98%)、二丁基羥基甲苯(BHT，純度≥99%)、維生素C(VC，純度≥99%)：分析標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Aladdin公司；

花生油、芝麻油、豬油：市售。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：EL104型，瑞士Mettler Toledo公司；

數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器：SZCL-2型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-1601型，北京北分瑞利分析儀器公司；

pH計(jì)：PHS-3E型，儀電科學(xué)儀器公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52型，上海嘉鵬科技有限公司；

氧化穩(wěn)定測(cè)定儀：734型，瑞士Metrohm公司；

紅外光譜儀：EQUNIOX-55型，德國(guó)Bruker公司；

核磁共振波譜儀：AVANCEIII型，瑞士布魯克公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 四氫姜黃素的合成 在100 mL圓底三口燒瓶中依次加入2.0 g乙酰丙酮、1.0 g三氧化二硼、20 mL乙酸乙酯，連接回流冷凝裝置，電熱套加熱至50 ℃，在磁力攪拌下反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后加入6.1 g香蘭素，9.2 g硼酸三丁酯，攪拌30 min。再將2 mL三乙胺溶于10 mL乙酸乙酯，在30 min內(nèi)緩慢滴加至圓底三口燒瓶中，滴加完成后，反應(yīng)溫度控制在50 ℃，反應(yīng)4 h。加入30 mL鹽酸(0.4 mol/L)，升溫至60 ℃，攪拌反應(yīng)2 h。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到分液漏斗，靜置30 min，充分分層后，收集乙酸乙酯層，水層用30 mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾得濾液，減壓蒸餾除去乙酸乙酯，將得到的黃色固體進(jìn)行硅膠柱層析分離，洗脫體系為石油醚/乙酸乙酯，洗脫液比例(V石油醚∶V乙酸乙酯)為4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，進(jìn)行梯度洗脫，收集相同組分，減壓蒸餾得到姜黃素，橙黃色結(jié)晶粉末，重2.5 g，產(chǎn)率67.90%。

稱取10.0 g反應(yīng)產(chǎn)物姜黃素，加入高壓反應(yīng)釜中，再依次加入2.5 g鈀碳(Pd-C，4%)，300 mL丙酮，先通入氮?dú)庵脫Q出反應(yīng)釜中的空氣(重復(fù)3次)，再通入氫氣置換出氮?dú)?重復(fù)3次)，在機(jī)械攪拌(300 r/min)，壓力0.1 MPa，溫度25 ℃下反應(yīng)6 h。反應(yīng)完成后抽濾除去鈀碳，減壓蒸餾除去溶劑丙酮，將得到的淡黃色固體進(jìn)行硅膠柱層析分離，洗脫體系為正己烷/乙酸乙酯，洗脫液比例(V正己烷∶V乙酸乙酯)為5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，進(jìn)行梯度洗脫，收集相同組分，減壓蒸餾得到白色結(jié)晶粉末，即為四氫姜黃素，重6.8 g，熔點(diǎn)91～92 ℃(文獻(xiàn)[3]值：92～93 ℃)，產(chǎn)率67.30%。根據(jù)上述兩步反應(yīng)的產(chǎn)率得到四氫姜黃素合成總產(chǎn)率為45.70%。合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 四氫姜黃素的合成路線圖Figure 1 Synthetic route of tetrahydrocurcumin

1.2.2 純度分析 采用紫外—可見(jiàn)分光光度法。將四氫姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品的乙醇溶液(質(zhì)量濃度約為10 mg/L)用紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到四氫姜黃素的最大吸收波長(zhǎng)。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定不同質(zhì)量濃度的四氫姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品乙醇溶液吸光度，以吸光度和質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定已知質(zhì)量濃度的產(chǎn)物的吸光度，根據(jù)產(chǎn)物吸光度和線性回歸方程計(jì)算出產(chǎn)物中四氫姜黃素含量。

1.2.3 四氫姜黃素的體外抗氧化性測(cè)定

(1) DPPH自由基清除能力：配制質(zhì)量濃度的四氫姜黃素、BHT、VC溶液作為待測(cè)樣液。參考文獻(xiàn)[4]的方法，將0.3 mL各待測(cè)液和3 mL DPPH (0.1 mmol/L)充分混勻，室溫條件下避光靜置30 min后，在517 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)以乙醇代替試樣溶液做空白試驗(yàn)。根據(jù)式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

X1——自由基清除率，%；

A1——試樣液吸光度；

A0——空白試液吸光度。

(2) ABTS自由基清除能力：配制不同質(zhì)量濃度的四氫姜黃素、BHT、VC溶液作為待測(cè)樣液。參考文獻(xiàn)[5]的方法配制ABTS工作液，將0.3 mL各待測(cè)樣液與3 mL ABTS工作液充分混勻，室溫條件下避光靜置10 min后，在734 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)以乙醇代替試樣溶液做空白試驗(yàn)。根據(jù)式(1)計(jì)算ABTS自由基清除率。

(3) 總抗氧化能力：配制不同質(zhì)量濃度的四氫姜黃素、BHT、VC溶液作為待測(cè)樣液。參考文獻(xiàn)[6]的方法，將0.3 mL各待測(cè)樣液與3.0 mL試劑溶液(0.6 mol/L的硫酸、28 mmol/L的磷酸鈉、4 mmol/L的鉬酸銨各1 mL)充分混勻，置于95 ℃恒溫水浴90 min，冷卻后，在695 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)以乙醇代替試樣溶液做空白試驗(yàn)。

(4) 鐵離子還原能力：配制不同質(zhì)量濃度的四氫姜黃素、BHT、VC溶液作為待測(cè)樣液。參考文獻(xiàn)[7]的方法配制FRAP試液，取3 mL預(yù)熱的FRAP試液，加入0.3 mL的待測(cè)樣液，充分混合后于37 ℃水浴條件下避光反應(yīng)30 min。于593 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)以乙醇代替待測(cè)樣液做空白試驗(yàn)。

(5) 金屬離子鰲合能力：配制不同質(zhì)量濃度的四氫姜黃素、BHT、VC溶液作為待測(cè)樣液。參考文獻(xiàn)[8]的方法，取2.4 mL各待測(cè)樣液于10 mL具塞試管中，加入30 μL FeCl2溶液(2 mmol/L)和60 μL菲啰嗪溶液(5 mmol/L)，充分混勻后在室溫放置10 min，在562 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)以乙醇代替試樣溶液做空白試驗(yàn)。根據(jù)式(2)計(jì)算亞鐵離子螯合率。

(2)

式中：

X2——亞鐵離子螯合率，%；

A2——試樣液在562 nm處吸光度；

A3——空白試液在562 nm處吸光度。

1.2.4 四氫姜黃素在油脂中的抗氧化性測(cè)定 參照GB/T 21121—2007《動(dòng)植物油脂 氧化穩(wěn)定性的測(cè)定(加速氧化測(cè)試)》，采用氧化穩(wěn)定測(cè)定儀測(cè)定四氫姜黃素在花生油、芝麻油、豬油中的抗氧化能力，并與BHT進(jìn)行對(duì)比。試驗(yàn)測(cè)定條件：油脂添加量為3.0 g，四氫姜黃素、BHT添加量為0.2 g/kg，空氣流速為10 L/h，加熱溫度為120 ℃。平行測(cè)定3次，取氧化誘導(dǎo)時(shí)間平均值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 使用Excel和Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)結(jié)果為3次平行測(cè)定的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物純度

用紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示，四氫姜黃素在239 nm處有最大吸收。配制質(zhì)量濃度為2，4，6，8，10 mg/L的四氫姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品乙醇溶液，在239 nm 處測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：y=0.045 3x+0.009 5，R2=0.998 0。同時(shí)測(cè)得質(zhì)量濃度為6 mg/L的產(chǎn)物在239 nm處的吸光度為0.275，經(jīng)計(jì)算產(chǎn)物中四氫姜黃素含量為97.68%，即產(chǎn)物純度為97.68%。

圖2 四氫姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 產(chǎn)物紅外光譜表征

圖3 產(chǎn)物的紅外光譜圖Figure 3 IR spectrogram of product

2.3 產(chǎn)物核磁共振波譜分析

2.3.1 產(chǎn)物核磁氫譜 產(chǎn)物的核磁共振氫譜如圖4所示，

圖4 產(chǎn)物的1H-NMR譜圖Figure 4 1H-NMR spectrum of product

1H-NMR (500 MHz，CDCl3)分析如下：δ6.66～6.83(m，6H，H-2’ 5’ 6’ 2” 5” 6”)，δ5.42～5.51(m，2H，H-4)，δ3.86(s，6H，—OCH3)，δ2.53～2.86(m，8H，H-1 2 6 7)，其中化學(xué)位移為7.26的峰為溶劑峰CDCl3，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道相同。

2.3.2 產(chǎn)物核磁碳譜 產(chǎn)物的核磁共振碳譜如圖5所示，13C-NMR(500 MHz，CDCLl3) 分析如下：δ198.18(C3，C5)，δ146.38(C3’，C3”)，δ143.95(C4’，C4”)，δ132.53(C1’，C1”)，δ120.78(C6’，C6”)，δ114.30(C2’，C2”)，δ110.89(C5’，C5”)，δ99.79(C4)，δ55.84(C3’—OCH3，C3” —OCH3)，δ40.36(C1，C7)，δ31.28(C2，C6)，其中化學(xué)位移為77的峰為CDCL3的溶劑峰，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道相同。

圖5 產(chǎn)物的13C-NMR譜圖Figure 5 13C-NMR spectrum of product

產(chǎn)物的IR、1H-NMR及13C-NMR數(shù)據(jù)與目標(biāo)化合物四氫姜黃素一致，確定合成產(chǎn)物為四氫姜黃素。

2.4 四氫姜黃素的體外抗氧化性試驗(yàn)

2.4.1 清除DPPH自由基能力 由圖6可以觀察到，VC在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，四氫姜黃素在0～60 mg/L的試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)擁有良好的線性關(guān)系，而對(duì)于BHT，濃度較高時(shí)，BHT的質(zhì)量濃度與自由基清除率線性較差，這時(shí)可以通過(guò)縮小抗氧化劑的濃度范圍，獲得線性關(guān)系良好的擬合曲線，并計(jì)算其清除50% ABTS自由基時(shí)四氫姜黃素質(zhì)量濃度值(IC50值)。計(jì)算得出四氫姜黃素、BHT和VC對(duì)DPPH自由基的IC50值分別為(74.33±0.003)，(169.76±0.003)，(52.47±0.004) mg/L。IC50值越低，表明清除DPPH自由基能力越強(qiáng)，反之則越弱。由此可知，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，四氫姜黃素對(duì)DPPH自由基的清除能力稍低于VC，但明顯高于BHT。

圖6 四氫姜黃素、BHT、VC對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.4.2 清除ABTS自由基能力 如圖7所示，3種抗氧化劑在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。計(jì)算得出，四氫姜黃素、BHT和VC對(duì)ABTS自由基的IC50值分別為(17.15±0.004)，(17.51±0.004)，(34.53±0.004) mg/L。由此可知，四氫姜黃素對(duì)ABTS自由基的清除能力與BHT接近，但明顯高于VC。

圖7 四氫姜黃素、BHT和VC對(duì)ABTS自由基的清除能力

2.4.3 總抗氧化能力 如圖8所示，隨著質(zhì)量濃度的增大，各抗氧化劑的總抗氧化能力均呈增加趨勢(shì)，且四氫姜黃素的總抗氧化能力明顯高于BHT和VC。

圖8 四氫姜黃素、BHT和VC的總抗氧化能力

2.4.4 鐵離子還原能力 在低pH的溶液中，F(xiàn)e3+和TPTZ會(huì)形成Fe3+-TPTZ(Fe3+-三吡啶三嗪)配合物，在有抗氧化劑存在時(shí)，配合物被還原成Fe2+-TPTZ，使溶液呈深藍(lán)色，在593 nm處有最大光吸收，且吸光度越大，表明對(duì)鐵離子還原能力越強(qiáng)。由圖9可知，四氫姜黃素的鐵離子還原能力顯著高于BHT和VC，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道結(jié)果一致。

圖9 四氫姜黃素、BHT和VC的鐵離子還原能力

2.4.5 金屬離子鰲合能力 如圖10所示，從鰲合趨勢(shì)上看，隨著四氫姜黃素質(zhì)量濃度的增大，其亞鐵離子螯合能力呈上升趨勢(shì)。而隨著BHT和VC質(zhì)量濃度的增大，其對(duì)亞鐵離子螯合能力反而減弱；從鰲合效果上來(lái)看，在質(zhì)量濃度為1 000 mg/L時(shí)，四氫姜黃素對(duì)亞鐵離子螯合能力雖然顯著高于BHT和VC，但螯合率低于25%，可見(jiàn)四氫姜黃素對(duì)亞鐵離子的螯合能力較弱。

圖10 四氫姜黃素的亞鐵離子鰲合能力Figure 10 Ferrous ions chelating activity oftetrahydrocurcumin

2.4.6 四氫姜黃素在油脂中的抗氧化性 由于VC是水溶性抗氧化劑，在油脂中的溶解性較差，因此只選擇脂溶性的BHT與四氫姜黃素進(jìn)行對(duì)比。由表1可知，添加了四氫姜黃素的3種油脂，其氧化誘導(dǎo)時(shí)間皆長(zhǎng)于未添加抗氧化劑的空白組，表明四氫姜黃素在這3種油脂中皆具有抗氧化作用，且在豬油中的抗氧化效果更明顯。

表1 油脂的氧化誘導(dǎo)時(shí)間?

3 結(jié)論

以香蘭素為起始原料，經(jīng)克萊森縮合反應(yīng)、鈀催化氫化反應(yīng)制備四氫姜黃素，經(jīng)紫外—可見(jiàn)分光光度、紅外光譜、核磁共振波譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。試驗(yàn)結(jié)果表明，合成路線可行且路線短，合成總產(chǎn)率達(dá)45.70%，產(chǎn)物純度為97.68%，與現(xiàn)有制備方法相比，試驗(yàn)方法原料成本低，具有潛在的價(jià)格優(yōu)勢(shì)。后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件，擴(kuò)大合成規(guī)模，以期實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

四氫姜黃素清除DPPH自由基的能力明顯高于二丁基羥基甲苯；清除ABTS自由基的能力接近于二丁基羥基甲苯且明顯高于維生素C，主要是由于其結(jié)構(gòu)中酚羥基的存在。此外，四氫姜黃素的總抗氧化能力和鐵離子還原能力均明顯高于二丁基羥基甲苯和維生素C，但對(duì)亞鐵離子的鰲合能力較弱，由此可知，四氫姜黃素的抗氧化能力主要體現(xiàn)在清除自由基和化學(xué)還原方面，與亞鐵離子螯合能力的相關(guān)性不大。四氫姜黃素在花生油、芝麻油、豬油等油脂中具有一定的抗氧化能力，并且對(duì)豬油的抗氧化效果最明顯，作為一種以天然產(chǎn)物為導(dǎo)向的抗氧化劑，安全性較好，有良好的應(yīng)用前景。