王 珍，脫浩亮

（中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠，蘭州 730046）

近年來，隨著口蹄疫疫苗生產(chǎn)工藝的技術(shù)升級(jí)，已從轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝全面轉(zhuǎn)型升級(jí)為懸浮培養(yǎng)工藝，但在種毒制備過程中還離不開轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝，而轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞的培養(yǎng)離不開血清，所以血清在口蹄疫疫苗生產(chǎn)的環(huán)節(jié)中扮演著至關(guān)重要的角色。但是血清的市場(chǎng)價(jià)格近幾年一直居高不下，而且還呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，為降低生產(chǎn)成本，號(hào)召國家節(jié)能減排的國策。本研究通過改變轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)中血清的加量探討口蹄疫轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的最佳血清加量。

1 材 料

1.1 種毒、轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞及培養(yǎng)基

BHK21轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞、口蹄疫O型及A型種毒，均由中牧股份蘭州生物藥廠提供；細(xì)胞培養(yǎng)基、1900病毒維持液，由宜興賽爾生物科技有限公司提供。以上材料均為保質(zhì)期內(nèi)正常材料。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

2～3日齡、正常生活的昆明系健康乳鼠，體重6～8g，由蘭州生物藥廠四車間飼養(yǎng)人員提供。

1.3 儀器與設(shè)備

15L玻璃細(xì)胞瓶、轉(zhuǎn)瓶機(jī)、超速離心機(jī)（型號(hào)為Beckman_L-100XP），均由蘭州生物藥廠配備。

2 方 法

將生長良好的轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞充分消化后，平均分成8份，分別加入血清含量為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的細(xì)胞培養(yǎng)液，按1∶5比例進(jìn)行分種，置37℃的轉(zhuǎn)瓶機(jī)中培養(yǎng)48h，觀察細(xì)胞生長情況并做詳細(xì)數(shù)據(jù)記錄。

將培養(yǎng)48h的轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞消化后，再加入相應(yīng)血清含量的細(xì)胞培養(yǎng)液，按1∶5比例進(jìn)行分種，置37℃的轉(zhuǎn)瓶機(jī)培養(yǎng)48h，觀察細(xì)胞生長情況并做詳細(xì)數(shù)據(jù)記錄，使其連續(xù)傳代5代。

將第5代培養(yǎng)48h不同血清含量的轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞棄去細(xì)胞廢液，分別將含有5%口蹄疫O型及A型種毒的1900維持液加入細(xì)胞瓶，每瓶500mL，觀察細(xì)胞病變情況并記錄詳細(xì)數(shù)據(jù)，待細(xì)胞病變達(dá)90%后收獲[1]。

按照“口蹄疫疫苗生產(chǎn)檢驗(yàn)規(guī)程”，用2～3日齡乳鼠檢測(cè)收獲病毒的半數(shù)致死量（LD50）。利用乳鼠進(jìn)行疫苗效力檢驗(yàn)，計(jì)算病毒的LD50。操作方法包括:在三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室將口蹄疫病毒不同梯度稀釋后接種乳鼠，規(guī)定時(shí)間內(nèi)統(tǒng)計(jì)小鼠死亡數(shù)，根據(jù)特有的公式計(jì)算病毒的LD50。

按照“口蹄疫疫苗生產(chǎn)檢驗(yàn)規(guī)程”，用蔗糖密度梯度離心法檢測(cè)口蹄疫病毒完整顆粒（146s）含量。口蹄疫病毒完整顆粒（146s）作為疫苗免疫時(shí)發(fā)揮作用的主要免疫原，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)热魏苇h(huán)節(jié)中的不同程度的降解都會(huì)引起動(dòng)物機(jī)體免疫后效力下降。按照蔗糖密度梯度超速離心法對(duì)口蹄疫病毒146s進(jìn)行分離純化，同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)在259nm處檢測(cè)吸收峰，并利用自動(dòng)化電腦軟件系統(tǒng)對(duì)吸收峰面積進(jìn)行計(jì)算，從而得出口蹄疫病毒粒子146s的含量。目前該方法仍然是各大口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)企業(yè)對(duì)各生產(chǎn)環(huán)節(jié)中146s含量檢測(cè)的主要技術(shù)。該方法也可用于成品苗中口蹄疫病毒146s抗原含量的測(cè)定[2]。

3 結(jié)果與分析

3.1 口蹄疫O型病毒轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞血清加量的影響

當(dāng)血清加量在3%～5%時(shí)，LD50及146s較為理想，細(xì)胞形態(tài)良好，病變時(shí)間適中，結(jié)果見表1。

表1 口蹄疫O型病毒轉(zhuǎn)瓶時(shí)細(xì)胞血清加量的影響

3.2 口蹄疫A型病毒轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞血清加量的影響

當(dāng)血清加量在3%～5%時(shí)，LD50及146s較為理想，細(xì)胞形態(tài)較好，病變時(shí)間適中，結(jié)果見表2。

表2 口蹄疫A型病毒轉(zhuǎn)瓶時(shí)細(xì)胞血清加量的影響

4 討論與小結(jié)

在口蹄疫疫苗種毒生產(chǎn)過程中，轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞血清加量在3%以上時(shí)，細(xì)胞生長48h均能形成致密的單層，細(xì)胞形態(tài)良好，接毒后細(xì)胞病變時(shí)間較為穩(wěn)定，病毒LD50及146s無明顯差別。而轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞血清加量在2%以下時(shí)，細(xì)胞生長48h未能形成致密的單層，細(xì)胞形態(tài)較差，接毒后細(xì)胞病變時(shí)間縮短，病毒LD50及146s含量較低。因此在口蹄疫疫苗轉(zhuǎn)瓶種毒生產(chǎn)過程中，應(yīng)結(jié)合轉(zhuǎn)瓶種毒LD50及146s結(jié)果、生產(chǎn)成本等因素綜合考慮，以確定BHK21轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)血清的加量[3]。

綜上所述，口蹄疫BHK21轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)的血清加量控制在3%～5%時(shí)較為理想，能達(dá)到試驗(yàn)要求又能滿足節(jié)能減排。

另外值得關(guān)注的是，轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞血清的加量還取決于細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)，如果細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)更為充足，則血清的加量還有可能降低，有待于進(jìn)一步探索。