孫啟亮，張惠喜，宋紅衛(wèi)，高英莉，肖 猛，魏戎蓉，朱 山，袁國(guó)良

（菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274000）

牡丹籽為芍藥科芍藥屬牡丹結(jié)的種子，是我國(guó)寶貴的民族藥材資源，在藏藥中可用于治療皮膚病、炭疽和高燒，民間多用于治療腰腿疼痛[1]。牡丹籽中含有芍藥苷[2]、單萜糖苷[3]、白藜蘆醇[4]等活性成分，具有抗菌、消炎、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用。而且，部分單萜苷類和芪類化合物為牡丹籽所獨(dú)有，但藥理作用未知，具有較高的研究?jī)r(jià)值。牡丹籽是一種特殊的中藥材，除藥用外，從中提取的牡丹籽油含有高比例不飽和脂肪酸[5]，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值[6]。2011年中華人民共和國(guó)衛(wèi)生與健康委員會(huì)將牡丹籽油批準(zhǔn)為新資源食品，這也使牡丹成為一種新型經(jīng)濟(jì)作物。牡丹籽粉是牡丹籽榨油后的副產(chǎn)物，可作為芍藥苷的提取原料[7]；牡丹籽中蛋白質(zhì)含量豐富，也可作為新型蛋白飼料來(lái)源[8]。合理開(kāi)發(fā)牡丹籽資源，可以實(shí)現(xiàn)牡丹由單純的觀賞功能向經(jīng)濟(jì)作物功能延伸，對(duì)形成更加細(xì)分的牡丹產(chǎn)業(yè)鏈、提高牡丹種植者的收入具有重要意義。

本試驗(yàn)以雌性昆明種小鼠為研究對(duì)象，分別采用長(zhǎng)期連續(xù)灌胃和一次性灌胃處理的方式，測(cè)定小鼠體重、臟器濕重、血清生化指標(biāo)、血常規(guī)指標(biāo)及排泄物中芍藥苷含量等，評(píng)估牡丹籽粉對(duì)小鼠生理指標(biāo)的潛在影響及排泄規(guī)律，以期為牡丹籽的合理利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 試驗(yàn)材料

1.1 牡丹籽粉

牡丹籽粉，購(gòu)自菏澤天寶牡丹生物科技有限公司，于4℃冰箱中保存，備用。

1.2 試劑與儀器

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）試劑盒、總膽紅素（TBil）試劑盒、總膽固醇（CHOL）試劑盒、總?cè)８视停═G）試劑盒、總蛋白（TP）試劑盒、白蛋白（ALB）試劑盒、肌酸激酶（CK）試劑盒、尿素（Urea）試劑盒、葡萄糖（GLU）試劑盒及鉀（K）、鈉（Na）、氯（Cl）試劑盒，均購(gòu)自北京豪邁生物科技股份有限公司；芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.8%），購(gòu)自Stanford Analytical chemicals公司；高效液相色譜儀（e2695），Waters公司產(chǎn)品；全自動(dòng)生化分析儀（Humastar600），Human公司產(chǎn)品；血細(xì)胞分析儀（BC-5000vet），Mindray公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，SPF級(jí)，雌性，42只，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。適應(yīng)飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度控制在20～26℃，相對(duì)濕度為40%～70%，維持12h光照，非灌胃期間自由采食全價(jià)日糧，每日觀察小鼠健康狀況。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

30只昆明種雌性小鼠按體重隨機(jī)分為5組，分別為空白組、低劑量組（1.25 g·kg-1體重）、中劑量組（2.5 g·kg-1體重）、高劑量組（5.0 g·kg-1體重）和溶劑對(duì)照組?？瞻捉M自由飲水、采食，不作灌胃處理；將牡丹籽粉分別以0.5%羧甲基纖維素鈉為溶劑稀釋成相應(yīng)劑量的混懸液作為劑量組；溶劑對(duì)照組按等體積灌胃法以0.5%羧甲基纖維素鈉作灌胃處理。灌胃1次·d-1，持續(xù)8周。

2.2 生理指標(biāo)測(cè)定

2.2.1 體重及臟器濕重

于試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天對(duì)小鼠稱重，之后每周稱重1次，記錄好數(shù)據(jù)。灌胃8周后觀察小鼠的采食、飲水、發(fā)病及死亡等情況，解剖分離小鼠胸腺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、卵巢、子宮等主要臟器進(jìn)行稱重，計(jì)算臟體比，臟體比=臟器濕重/單位體重[9]。

2.2.2 血清生化指標(biāo)和血常規(guī)指標(biāo)

用眼眶采血法分離血清和全血，血清用于測(cè)定AST、ALT、ALP、GGT、TBil、Urea、TP、ALB、CHOL、GLU、CK、TG、K、Na、Cl；全血用于測(cè)定白細(xì)胞（WBC）、嗜中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Neu%）、淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Lym%）、單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Mon%）、嗜酸性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Eos%）、嗜堿性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（Bas%）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、血細(xì)胞比容（HCT）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）。

2.3 牡丹籽粉排泄規(guī)律研究

2.3.1 牡丹籽粉中芍藥苷的提取與凈化

稱取牡丹籽粉樣品1g，置于250mL錐形瓶中，以料液比1∶20加入70%乙醇溶液，浸泡1h，超聲提取10min。靜置，取上清液稀釋后過(guò)0.22 μm濾膜供液相色譜檢測(cè)。

2.3.2 牡丹籽粉中芍藥苷的排泄及消除規(guī)律

將12只昆明小鼠隨機(jī)分為4組，單籠飼養(yǎng)，分別為空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。按生理指標(biāo)測(cè)定試驗(yàn)設(shè)計(jì)的劑量一次性灌胃給予牡丹籽粉，分別在試0～12、13～24h依次間隔12h收集糞便和尿液至灌胃后72h，將每次收集到的小鼠糞便稱重、研細(xì)、混合均勻后置于250mL錐形瓶中，余下操作同牡丹籽粉中芍藥苷的提取與凈化。將每次收集到的小鼠尿液置于10mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，混勻，稀釋后取上清液過(guò)0.22 μm濾膜供液相色譜檢測(cè)。排泄率=檢出量/總檢出量；消除率=（總灌胃量-總檢出量）/總灌胃量。

空白組小鼠不予灌胃，分別收集糞便和尿液作為空白樣。灌胃后小鼠自由采食和飲水。

2.4 色譜條件

色 譜柱 為Agilent Eclipse XDB-C18，5μm，250mm×4.6 mm；流動(dòng)相為甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（40∶65V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10μL；柱溫：30℃。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用IBM SPSS Statistics22軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差（one-way ANOVA）分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 生理指標(biāo)的測(cè)定

3.1.1 小鼠體重變化情況

體重?cái)?shù)據(jù)見(jiàn)表1。

分別將低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠體重與相應(yīng)周次的空白組小鼠體重相比，由表1可知，各組數(shù)據(jù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 試驗(yàn)小鼠各階段的體重 g

3.1.2 臟體比測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后解剖小鼠，各組小鼠胸腺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、卵巢、子宮組織均未見(jiàn)明顯異常。臟體比結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，灌胃8周后，小鼠低、中和高各劑量組與空白對(duì)照組小鼠的臟體比數(shù)據(jù)之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明經(jīng)口灌服的牡丹籽粉對(duì)小鼠臟器沒(méi)有顯著影響。

表2 各組試驗(yàn)小鼠的臟體比

3.1.3 小鼠血清生化指標(biāo)

血清相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。雌性小鼠經(jīng)灌胃8周后測(cè)定的15項(xiàng)生化指標(biāo)與空白組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組試驗(yàn)小鼠的血清生化指標(biāo)

3.1.4 小鼠血常規(guī)指標(biāo)

采集各組小鼠血液用肝素鈉抗凝，進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組試驗(yàn)小鼠的血常規(guī)指標(biāo)

與空白組相比，各劑量組測(cè)定的12項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 排泄規(guī)律研究

3.2.1 芍藥苷的線性范圍、回歸方程、檢測(cè)限及定量限

取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用流動(dòng)相稀釋成濃度為10、20、50、100、200μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行HPLC測(cè)定，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液測(cè)定3次，10μg·mL-1芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 芍藥苷的標(biāo)準(zhǔn)色譜

將各濃度與對(duì)應(yīng)峰面積均值作線性回歸，即得線性方程。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液線性范圍在10～200μg·mL-1時(shí)，其線性方程為：y=1.31 ×104x+6.16 ×103（r2=0.999064 ）。通過(guò)測(cè)定信噪比（S/N）確定其檢測(cè)限（S/N=3）。芍藥苷在尿液和糞便樣品中的最低檢測(cè)限分別為1.15 mg·kg-1、0.588 mg·L-1。

3.2.2 回收率與精密度

分別向空白組小鼠糞便和尿液樣品中加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，使芍藥苷濃度分別為5、10、20μg·mL-1，按照樣品制備方法處理后經(jīng)HPLC檢測(cè)?；厥章什捎没貧w方程擬合計(jì)算。每個(gè)濃度5個(gè)平行，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。芍藥苷在小鼠尿液和糞便中的回收率見(jiàn)表5，可見(jiàn)芍藥苷回收率為73%～100%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35 %～10.85 %，滿足定量分析方法的需要。

表5 芍藥苷在小鼠糞便和尿液中的回收率 %

3.3 芍藥苷的消除規(guī)律

小鼠一次性灌服牡丹籽粉后，在給藥0～72h時(shí)間段的尿液中芍藥苷含量均在檢測(cè)限以下；在糞便中的檢出數(shù)據(jù)及排泄率、消除率見(jiàn)表6～表7。

由表6～表7可知，在0～24h和25～48h內(nèi)均能檢測(cè)到芍藥苷，48～72h內(nèi)的數(shù)據(jù)在檢測(cè)限以下。

表6 一次性灌服牡丹籽粉后糞便中芍藥苷的檢出量及排泄率

表7 芍藥苷總灌胃量及消除率

4 討 論

4.1 生理指標(biāo)測(cè)定

連續(xù)灌胃8周后，雌性小鼠空白組胸腺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、卵巢、子宮等器官的臟體比指標(biāo)和血清AST、ALT、ALP、GGT、TBil、Urea、TP、ALB、CHOL、GLU、CK、TG、K、Na、Cl含量水平以及血液WBC、Neu%、Lym%、Mon%、Eos%、Bas%、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、PLT水平與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果說(shuō)明牡丹籽粉對(duì)雌性小鼠的生長(zhǎng)性能無(wú)影響，對(duì)臟器無(wú)損傷。

試驗(yàn)動(dòng)物生理指標(biāo)是反映動(dòng)物生長(zhǎng)性能的參考指標(biāo)，也是評(píng)估臟器功能的基礎(chǔ)依據(jù)[10]。在肉雞基礎(chǔ)日糧中分別按5%、10%的比例添加牡丹籽粕，與基礎(chǔ)日糧組相比，肉雞日采食量顯著降低而平均日增重和血生化指標(biāo)以及血常規(guī)指標(biāo)無(wú)顯著差異，提示此劑量的牡丹籽粕可提高飼料利用率，且此劑量下肉雞臟器未見(jiàn)損傷[11]。由于牡丹籽中含有的多糖具有良好的抗氧化性能[12]，試驗(yàn)組日糧中含有的牡丹多糖對(duì)臟器的保護(hù)作用與生理指標(biāo)變化的相關(guān)性尚需試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4.2 牡丹籽粉排泄規(guī)律

牡丹籽含有多種活性化合物，包括單萜苷類、低聚芪類、鞣質(zhì)類、三萜和甾體類、黃酮類、丹皮酚類、多糖等。這些化合物以芍藥苷含量相對(duì)最高，且含有的芍藥苷類似物多達(dá)十幾種[13]，所以芍藥苷可以作為標(biāo)志物用來(lái)評(píng)估牡丹籽粉在小鼠體內(nèi)的排泄規(guī)律。經(jīng)一次性灌胃后排泄物中檢測(cè)到的芍藥苷總量結(jié)果顯示，低、中、高劑量的牡丹籽粉排泄率在0～24h之內(nèi)均在90%以上，在49～72h之內(nèi)完全排泄；各劑量組中芍藥苷經(jīng)代謝消除的比例分別為76.2 %、54.0 %和54.5 %，提示隨著灌胃劑量從中劑量提高到高劑量，芍藥苷的消除率未發(fā)生變化，可能原因是牡丹籽粉蛋白質(zhì)含量豐富[14]，對(duì)芍藥苷的代謝產(chǎn)生了保護(hù)效應(yīng)。

5 小 結(jié)

本試驗(yàn)采用長(zhǎng)期連續(xù)灌胃和一次性灌胃的方式分別采用不同劑量（1.25 、2.5 、5.0 g·kg-1體重）牡丹籽粉處理小鼠，用小鼠體重、臟體比、血清生化指標(biāo)、血常規(guī)等參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，用糞便和尿液中芍藥苷的含量對(duì)牡丹籽粉的排泄規(guī)律進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)牡丹籽粉對(duì)雌性小鼠的生長(zhǎng)無(wú)影響，其對(duì)雄性小鼠的影響尚需要進(jìn)一步研究。