李 丹，黃育剛，湯顯斌

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常見的原發(fā)性惡性肝腫瘤之一，約占肝腫瘤的80%[1]。在我國HCC引起的腫瘤相關(guān)病死率位居第三，僅次于肺癌和胃癌[2]，其5年生存率低于18%[3-4]。CENPF(Centromeric protein F)是細(xì)胞周期相關(guān)的核抗原。研究表明，CENPF在肝癌[5]、乳腺癌[6]、前列腺癌[7-8]等多種人類惡性腫瘤中存在異常表達。雖然關(guān)于CENPF在HCC中的表達情況已有報道[9]，但其生物學(xué)過程和分子機制等尚不清楚。本實驗結(jié)合HCC臨床樣本及腫瘤基因數(shù)據(jù)庫，對CENPF表達與患者預(yù)后的相關(guān)性、潛在信號通路進行探討，以期為HCC的早期診斷、預(yù)后評估和抗腫瘤治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)提取運用GEO數(shù)據(jù)庫、TCGA和Oncomine平臺篩選與HCC相關(guān)的數(shù)據(jù)集。在GEO數(shù)據(jù)庫中，包含人HCC及其鄰近或正常肝組織，且病例數(shù)200以上的，共篩選到2個數(shù)據(jù)集，即GSE14520和GSE25097。基于TCGA、Oncomine平臺中HCC相關(guān)信息，分析CENPF在HCC及正常肺組織中的表達差異、與臨床分期及病理分級的相關(guān)性。此外，應(yīng)用GEPIA平臺分析CENPF與HCC患者預(yù)后的關(guān)系。

基于TCGA數(shù)據(jù)庫，用SPSS 25.0軟件進行CENPF表達與年齡、性別、臨床分期、病理分級等臨床參數(shù)的相關(guān)性分析；應(yīng)用GSEA 4.0.3軟件進行基因集富集分析，在HCC中，探索與CENPF基因表達可能相關(guān)的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、Hallmark和Biocarta信號通路。

1.2 材料收集2019年12月～2020年12月十堰市太和醫(yī)院病理科存檔的HCC及對應(yīng)癌旁正常組織，選取有完整病歷及臨床信息全面的樣本，合計18例；所有病例均未行放、化療，所有病理指標(biāo)均經(jīng)過兩位病理醫(yī)師重新評定，并達成一致的意見。

1.3 免疫組化對18例HCC及癌旁正常組織，各取3 μm厚組織切片，用EDTA(pH 9.0)進行熱修復(fù)，玻片與CENPF抗體(英國Abcam公司，稀釋濃度1 ∶400)在37 ℃孵育1 h，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(福州邁新公司，貨號KIT5230)37 ℃孵育0.5 h，蘇木精復(fù)染30 s。在光學(xué)顯微鏡下觀察，并評估腫瘤細(xì)胞中CENPF蛋白表達的陽性細(xì)胞占比。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.2軟件作圖并運用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，正常組織與HCC組織中CENPF的表達差異比較采用t檢驗，設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同HCC芯片中CENPF的表達對GEO的兩個數(shù)據(jù)集應(yīng)用GEO2R進行表達差異分析，GSE14520數(shù)據(jù)集包含220例正常肝組織和225例HCC組織，GSE25097數(shù)據(jù)集包含243例正常肝組織和268例HCC組織。在GSE14520和GSE25097數(shù)據(jù)集中，CENPF在HCC中的表達量均高于正常肝組織(P<0.000 1，圖1A、B)。TCGA數(shù)據(jù)庫包含50例正常肝組織和388例HCC組織，分析顯示CENPF在HCC中的表達量高于正常肝組織(P<0.000 1，圖1C)。通過Oncomine平臺分析Chen等的HCC數(shù)據(jù)(包含62例正常肝組織和101例HCC組織)，結(jié)果顯示CENPF在HCC中的表達量高于正常肝組織(P<0.000 1，圖1D)。本組免疫組化檢測顯示CENPF表達定位在細(xì)胞核，且在HCC中的表達顯著高于癌旁正常組織(P<0.000 1，圖2)。

2.2 HCC中CENPF與臨床病理特征的關(guān)系在TCGA中，根據(jù)CENPF表達的中位值將374例HCC樣本分為低表達組(187例)和高表達組(187例)，分析CENPF表達與HCC臨床病理特征的關(guān)系。在HCC中，CENPF表達與患者年齡、性別、有無血管侵犯無關(guān)。隨著臨床分期升高，CENPF高表達例數(shù)顯著多于CENPF低表達例數(shù)(尤其臨床分期Ⅱ、Ⅲ期，P=0.002，表1)。隨著病理分級升高，CENPF高表達例數(shù)顯著多于CENPF低表達例數(shù)(尤其病理分級3級，P<0.001)。CENPF高表達者更容易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)。AFP為肝癌的特異性標(biāo)志物之一，當(dāng)AFP濃度>400 μg/L時，CENPF高表達例數(shù)顯著多于CENPF低表達例數(shù)(P<0.001)。

表1 HCC中CENPF表達與臨床病理特征的關(guān)系

此外，采用單因素、多因素Cox回歸分析，探討CENPF表達與HCC患者年齡、性別、分級、TNM分期、腫瘤復(fù)發(fā)等臨床因素對患者預(yù)后的影響。單因素Cox回歸分析表明CENPF表達和TNM分期與HCC患者的預(yù)后相關(guān)(P<0.01)。多因素Cox回歸分析表明CENPF表達和TNM分期是HCC患者的獨立預(yù)后因素(P<0.01，表2)。

表2 CENPF在肝細(xì)胞肝癌中的單因素、多因素Cox回歸分析

2.3 CENPF在HCC不同臨床分期、病理分級中的表達結(jié)合TCGA表達矩陣及對應(yīng)的臨床信息，分別分析了CENPF mRNA在正常組織及臨床分期Ⅰ～Ⅳ期、病理分級1～4級中的表達量。結(jié)果顯示，CENPF mRNA表達量與臨床分期(圖3A)和病理分級(圖3B)呈正相關(guān)，表明CENPF異常表達與HCC惡化程度及疾病的進展相關(guān)。

圖3 HCC不同臨床分期、病理分級中CENPF的表達：A.臨床分期；B.病理分級；ns. P>0.05，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1

2.4 HCC中CENPF表達與預(yù)后的關(guān)系應(yīng)用GEPIA平臺繪制生存曲線，結(jié)果顯示CENPF表達與患者預(yù)后，即總生存率、無瘤進展生存率均呈負(fù)相關(guān)性(P=0.001 8，P=0.001 9，圖4)。

圖4 CENPF表達與HCC患者預(yù)后的關(guān)系：A. CENPF表達與HCC患者總生存率的關(guān)系；B. CENPF表達與HCC患者無瘤進展生存率的關(guān)系；P<0.01

2.5 CENPF在HCC中的基因集富集分析基于TCGA數(shù)據(jù)庫使用GSEA軟件進行基因集富集分析，探討CENPF在HCC發(fā)生發(fā)展中潛在的分子機制。GSEA分析顯示，在HCC中，與CENPF高表達最密切相關(guān)的KEGG信號通路是細(xì)胞周期(圖5A)；與CENPF高表達最密切相關(guān)的Hallmark信號通路是轉(zhuǎn)錄因子E2F及細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)換(圖5B)；與CENPF高表達最密切相關(guān)的Biocarta信號通路是MAPK信號通路(圖5C)。

圖5 CENPF在HCC中的GSEA富集分析：A. CENPF的KEGG富集分析；B. CENPF的Hallmark富集分析；C. CENPF的Biocarta富集分析；NES.標(biāo)準(zhǔn)富集分?jǐn)?shù)(Normalized enrichment score)

3 討論

目前，外科手術(shù)是治療早期HCC的主要方式，大部分HCC患者在確診時已失去手術(shù)治療的最佳時機。近20年來，分子生物學(xué)研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了TERT、TP53、CTNNB1等與HCC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因及相關(guān)靶向藥物。然而，HCC晚期患者對臨床上使用的大多數(shù)化療藥物表現(xiàn)出耐藥現(xiàn)象[10]。另外，這些基因突變只存在于部分HCC患者中，因此繼續(xù)尋找HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子或靶點，對于研發(fā)治療HCC的新藥物具有重要的理論和臨床意義。

CENPF的主要功能是在有絲分裂期維持紡錘體的穩(wěn)定及分布[9]。已有研究表明，CENPF表達異常與肝癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的進展或預(yù)后有密切聯(lián)系，而關(guān)于CENPF在HCC中的生物學(xué)過程及分子機制鮮有報道[11]。本實驗基于多個公共數(shù)據(jù)庫和臨床樣本的分析顯示，與正常肝組織相比，HCC組織中CENPF顯著高表達(P<0.001)。CENPF高表達與臨床分期、病理分級呈正相關(guān)，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，這表明CENPF異常表達與HCC的惡化程度及疾病進展相關(guān)。通過CENPF表達與臨床病理特征的相關(guān)性及單因素、多因素Cox回歸分析表明，CENPF表達與臨床分期、病理分級、AFP及腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)，且CENPF可能是HCC患者預(yù)后的獨立預(yù)后因素。通過GSEA分析表明，CENPF表達與HCC細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，CENPF可能通過轉(zhuǎn)錄因子E2F、MAPK信號途徑調(diào)控HCC細(xì)胞在G2/M期的轉(zhuǎn)換，從而影響細(xì)胞周期，但這些推論還需要分子生物學(xué)實驗等進一步驗證。

綜上，本實驗分析了CENPF表達與HCC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，為進一步探討分子機制提供了理論支持和線索，以期對HCC發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的研究提供參考。