烏蘭托雅，李睿亞

內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017

黃褐斑是一種后天獲得性、慢性發(fā)病的色素增加性皮膚病，發(fā)病機制尚不完全清楚，考慮與紫外線照射、內(nèi)分泌因素、自由基損傷、炎癥反應(yīng)、色素代謝異常、皮膚屏障功能紊亂、皮膚血管因素、遺傳易感性等多種致病因素相關(guān)。黃褐斑的治療，現(xiàn)以局部治療多見，外用藥物配合激光治療效果較肯定。大豆富含異黃酮、皂苷、多肽等生理活性物質(zhì)，在抗氧化、清除自由基、預(yù)防骨質(zhì)疏松及心血管疾病等方面具有重要價值［1-3］。皮膚屏障對于維持皮膚正常生理功能極為重要，但會影響外用藥物透皮吸收。為了提高局部藥物的吸收率，藥物透皮技術(shù)應(yīng)運而生。新興透皮技術(shù)納米微針（簡稱納晶），其高晶硅納米級針尖可穿透角質(zhì)層，在表皮上建立給藥通道，而不損傷真皮層，吸收效果提高10～20倍［4］。激光治療黃褐斑是一把“雙刃劍”，既要充分發(fā)揮祛除色斑優(yōu)勢，又要避免術(shù)后色素沉著，選擇適宜的治療參數(shù)，避免術(shù)后炎癥反應(yīng)，是激光治療的關(guān)鍵所在［5］。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，采用大光斑低能量調(diào)Q1064 nm多次治療黃褐斑效果顯著［6］，可有效調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激狀態(tài)，比強脈沖光臨床療效更顯著［7］，是近幾年廣受推崇的治療方法。

鑒于此，本研究擬聯(lián)合運用納米微針導(dǎo)入大豆提取液和調(diào)Q1064 nm 激光的方式治療黃褐斑豚鼠模型，對其治療前、后進行實驗觀察，評估治療效果，為黃褐斑治療提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

成年雌性豚鼠，60 只，清潔級，體重320～380 g。購于北京海淀區(qū)興隆實驗動物養(yǎng)殖場，許可證號：SCXK（京）2016-0003。

SH2B 紫外線光療儀（上海希格瑪公司），黃體酮注射液（浙江仙琚制藥），大豆提取液（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實驗室制備，采用低溫萃取法獲得的液體，需低溫保存），Q 開關(guān)1064nm（Nd：YAG）激光治療機（吉林科英），納米晶片促滲儀（蘇州納通生物），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（南京建成生物工程），黑色素瘤鼠單克隆抗體Melan A（北京博奧森），Olympus 光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司，日本），CMIAS 多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)（空總醫(yī)院與北航大學(xué)共同研制）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

60 只豚鼠隨機抽取12 只，作為A 組（空白對照組），不造模，不治療；剩余48 只為B 組（模型制備組）。造模45 d，隨機分為4 組：分別為B1 組（模型對照組）不治療；B2 組（激光治療組）相同參數(shù)激光治療，每周1 次，治療5 次；B3 組（大豆治療組）納晶促滲儀導(dǎo)入大豆提取液，每日1 次，治療5 周；B4 組（大豆聯(lián)合激光組）兩種方式聯(lián)合治療。

1.2.2 黃褐斑豚鼠模型制備

脫毛采用上蠟法［8］，豚鼠背部脫毛范圍約4 cm×4 cm。采用“紫外線照射法［7］”+“黃體酮沖擊法［9］”制備模型，豚鼠置于固定籠內(nèi)，與光源的距離為20 cm，連接電源打開SH2B 紫外線光療儀，每日照射1次，每次30 min，連續(xù)45 d。黃體酮注射液配置成安全劑量2 mL/kg，豚鼠后肢消毒后肌肉注射，每日1次，雙后肢交替注射，連續(xù)45 d。

1.2.3 模型治療

調(diào)Q1064 nm 激光：波長1 064 nm，光斑8 mm，能量密度1～2 J/cm2［10-11］，助手固定好豚鼠治療區(qū)域，在治療區(qū)域從左至右均勻掃描2遍，光斑重疊不超過10%，皮膚輕微發(fā)紅停止治療，每周1次，治療5次，每次約1 min。

納米微針導(dǎo)入方法：清潔豚鼠治療區(qū)域，納米晶片安裝在納晶促滲儀頭部，將大豆提取液（20 mg/mL）垂直滴于納米晶片上，開啟電源，在治療區(qū)域從左至右平行滑動且垂直按摩2遍，每日1次，治療5周。

1.2.4 取材

在造模后（治療前）、治療1周即刻、治療5周即刻、治療結(jié)束3周取材。取材前1 d脫毛，豚鼠腹腔注射10%水合氯醛水溶液（安全劑量0.3 mL/100g［12-14］），麻醉15 min 后，助手固定好豚鼠，用無菌手術(shù)器械迅速在皮損處取適量的皮膚組織。

1.2.5 各項指標(biāo)觀測

表觀指標(biāo)：觀察豚鼠背部實驗區(qū)域皮膚的變化，如色斑顏色深淺、面積大小、毛發(fā)光澤度。

皮膚CT：取材前用皮膚CT逐層掃描治療區(qū)域皮膚，觀察表、真皮變化，特別是表皮黑素細(xì)胞（melanocyte，MC）、黑素顆粒等。

皮膚SOD 活性、MDA 水平的測定：豚鼠背部皮膚取約5 mg組織，用4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙吸去水分，組織切碎待用。按說明書配制實驗試劑，分別用羥胺法及硫代巴比妥酸測定。

免疫組化檢測Melan A：石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，一抗Melan A 抗體4 ℃過夜孵育，二抗山羊抗兔IgG 抗體室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，不同濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

MC相關(guān)數(shù)據(jù)：顯微鏡物鏡下，每張片隨機選擇不同視野，用病理圖像分析系統(tǒng)對黑素陽性目標(biāo)圖像采集、存儲、定量分析，記錄各組不同時期MC 陽性目標(biāo)數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS22.0對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，經(jīng)檢驗均符合正態(tài)分布，采用方差分析進行比較，組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組表觀指標(biāo)變化

造模后B1、B2、B3、B4 組背部造模區(qū)域出現(xiàn)不規(guī)則形的黑褐色斑片，與A組對比鮮明，提示造模成功。A 組、B1 組在治療前、治療1 周即刻、治療5 周即刻、治療結(jié)束3周未見明顯變化。

治療后B4 組色斑基本消退，B4 組治療區(qū)域近似于A組背部皮膚，療效明顯，B2、B3組可見散在分布色斑，顏色較前變淺。各組治療結(jié)束3 周均未出現(xiàn)色沉及復(fù)發(fā)（圖1）。

圖1 各治療組不同時期皮膚表現(xiàn)

2.2 各組皮膚CT結(jié)果

與B1 組相比，B4 組的MC 和黑素顆粒顯著減少，B2、B3 組的MC 和黑素顆粒也減少。治療結(jié)束后，B2、B3、B4組豚鼠的表皮較治療前變薄，顆粒層含少量黑素顆粒，基底層黑素含量顯著降低，可見散在分布的MC，黑素顆粒顯著減少，偶可見樹枝狀細(xì)胞，真皮淺層可見少許黑素顆粒（圖2）。

圖2 各治療組不同時期皮膚CT表現(xiàn)

2.3 各組皮膚SOD活力、MDA含量的變化

B2、B3、B4組治療前、后，SOD活力及MDA含量均有差異（P＜0.05），說明3 組治療方法均有療效。通過方差分析，兩兩組間比較均有差異（P＜0.05），B4組聯(lián)合治療療效最顯著（表1、2）。

表1 各組不同時期豚鼠皮膚SOD活力變化 （U/mg，）

表1 各組不同時期豚鼠皮膚SOD活力變化 （U/mg，）

與治療前比較，*P ＜0.05；與A組比較，#P ＜0.05；與B1組比較，△P ＜0.05。

2.4 各組Melan A免疫組化結(jié)果

B1組鏡下可見陽性MC、黑素顆粒較多，呈強陽性反應(yīng)；基底細(xì)胞層可見分布密集的陽性MC，MC胞體及胞核較大，伴核上移；基底細(xì)胞層以上可見大量呈線狀或帶狀致密的黑素顆粒，著色較深。B2、B3 組鏡下可見陽性MC、黑素顆粒減少；基底細(xì)胞層偶可見少量棕黃色MC；基底細(xì)胞層以上偶可見少量的黑素顆粒。B4組鏡下可見陽性MC、黑素顆粒數(shù)量顯著減少，基底細(xì)胞層偶可見少量呈棕黃色MC和極少量的黑素顆粒（圖3）。

圖3 各治療組不同時期皮膚Melan A免疫組化鏡下表現(xiàn)（×400）

2.5 各組MC陽性目標(biāo)數(shù)量比較

治療5周即刻，B2、B3、B4組與治療前相比，MC陽性目標(biāo)數(shù)量都顯著下降（P＜0.05）。B4 組MC 陽性目標(biāo)數(shù)量變化最顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），因此B4組治療效果最佳（表3）。

表3 各治療組不同時期豚鼠皮膚MC陽性目標(biāo)數(shù)量比較 （個/400倍視野，）

表3 各治療組不同時期豚鼠皮膚MC陽性目標(biāo)數(shù)量比較 （個/400倍視野，）

與治療前比較，*P ＜0.05；與A組比較，#P ＜0.05；與B1組比較，△P ＜0.05。

3 討論

MC 起源于神經(jīng)嵴，是合成和分泌黑素的樹枝狀細(xì)胞。多項研究表明，黃褐斑病變區(qū)與周圍正常皮膚相比，組織學(xué)特征為表皮變薄、表皮突變平，MC增大，且樹突明顯突出，MC功能活躍，黑素合成增加，基底層黑素顯著增多，真皮淺層偶有游離黑素顆粒和噬黑素細(xì)胞，但MC數(shù)量有無變化尚不明確［15-17］。長期反復(fù)紫外線照射，能引起MC增殖和功能活躍，產(chǎn)生更多的黑素導(dǎo)致色素沉著［18-20］。雌激素和黃體酮增多刺激MC 致色斑形成。研究表明，豚鼠表皮內(nèi)MC 和黑素小體分布與人體相似，若暴露紫外線下也有類似人體的色沉反應(yīng)［21］。

皮膚CT 對黃褐斑的診療具有重要意義。檢測優(yōu)勢包括：進行無創(chuàng)分型，根據(jù)鏡下MC形態(tài)判斷是否處于活躍期，從而指導(dǎo)治療方法的選擇。造模后皮膚CT鏡下角化過度、棘層肥厚、基底層較多的MC呈簇狀分布，黑素顆粒明顯增多，彌漫分布呈強折光性粗大顆粒，形似“繁星點點”，也可見樹枝狀增殖活躍MC。真皮淺層可見少許黑素顆粒沉積，周圍偶可見不規(guī)則性的噬黑素細(xì)胞。與A 組相比，造模后豚鼠基底層黑素含量顯著增加，MC活躍，符合黃褐斑皮膚CT鏡下特點，提示黃褐斑豚鼠模型造模成功。

表2 各組不同時期豚鼠皮膚MDA含量變化 （nmol/mg，）

表2 各組不同時期豚鼠皮膚MDA含量變化 （nmol/mg，）

與治療前比較，*P ＜0.05；與A組比較，#P ＜0.05；與B1組比較，△P ＜0.05。

抗氧化劑是治療黃褐斑的重要措施。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，大豆治療組皮損得到改善，皮膚中SOD活力顯著升高，MDA含量顯著降低，MC 陽性目標(biāo)數(shù)量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明大豆提取液具有抗自由基作用，可以清除ROS，減輕紫外線損傷，修復(fù)受損細(xì)胞，抑制酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）活性，減少黑素形成等作用，與既往研究結(jié)果一致，但具體機制還有待進一步研究。配合納米微針可以達到很好的滲透作用，單一治療與聯(lián)合治療相比，效果欠佳，起效慢，需要長期外用，抑制MC活性、降低黑素形成的針對性不強。

本研究發(fā)現(xiàn)，造模后鏡下可見基底細(xì)胞層MC及黑素顆粒較多，呈強陽性反應(yīng)，聯(lián)合治療后，基底細(xì)胞層MC 及黑素顆粒數(shù)量顯著減少；通過病理圖像軟件定量分析，聯(lián)合治療后與治療前相比，MC陽性目標(biāo)數(shù)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明聯(lián)合治療效果優(yōu)于單一治療。

調(diào)Q1064 nm激光采用光爆破原理，靶組織選擇性吸收激光后，將光能轉(zhuǎn)化為熱能，迅速膨脹碎裂，細(xì)小顆?？杀痪奘杉?xì)胞吞噬、吸收。高能量激光治療黃褐斑易出現(xiàn)炎癥后色沉、水皰等不良反應(yīng)［21-24］。本研究采用低能量激光，盡量避免術(shù)后不良反應(yīng)，但同時色斑短期內(nèi)并不容易被祛除，需要多次治療逐漸達到治療效果。黃褐斑易復(fù)發(fā)，單一激光治療雖具有一定療效，但復(fù)發(fā)率較高被多項研究證實［25］。因此，需要聯(lián)合治療提高患者滿意度。

黃褐斑病程頑固，影響容貌美觀，臨床治療的重點是在保證臨床有效性的基礎(chǔ)上，控制不良反應(yīng)與復(fù)發(fā)。聯(lián)合治療后，MC陽性目標(biāo)數(shù)量顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療較單一治療效果更佳，為聯(lián)合治療提供動物實驗依據(jù)。