章海軍，黃嘉琛，錢考亮，胡 軍，范衛(wèi)民

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210029

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，以緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、僵硬伴活動受限等為主要臨床特點。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的變性退變是OA 的病理生理基礎(chǔ)，但其確切的病因機制目前仍不清楚［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，在人類OA組織標(biāo)本中，細(xì)胞凋亡與軟骨破壞和基質(zhì)消耗的程度呈正相關(guān)，在OA軟骨中，18%～21%的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡特征，而在正常軟骨中，這一比例僅為2%～5%［3］。靶向軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控正成為OA治療藥物研究的重要方向［4-5］。

煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）廣泛分布于多種細(xì)胞，其中α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7-nAChR）是由5 個α7 亞單位組成的同源五聚體。α7-nAChR具有快速激活、快速脫敏和對Ca2+高度滲透的特點，在膽堿能抗炎通路介導(dǎo)的神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性作用［6］。研究表明α7-nAChR 興奮后可產(chǎn)生一個快速衰減的內(nèi)向電流，通過直接打開離子通道或間接興奮電壓依賴型鈣通道而使細(xì)胞內(nèi)游離鈣水平提高，從而引發(fā)許多細(xì)胞內(nèi)下游事件，包括蛋白激酶的激活，即早基因的表達(dá)，新蛋白的合成，最終導(dǎo)致神經(jīng)元或非神經(jīng)元功能的變化，產(chǎn)生眾多生物學(xué)效應(yīng)［7-8］。

Van Maanen 等［9］構(gòu)建膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型，分為一側(cè)迷走神經(jīng)切除術(shù)或假切除術(shù)組、煙堿（nicotine，Nic）干預(yù)組、α7-nAChR激動劑組，結(jié)果表明迷走神經(jīng)切除后關(guān)節(jié)炎癥狀加重，而給予口服Nic 后關(guān)節(jié)癥狀得到緩解，同時口服Nic 可抑制骨降解和抑制滑膜組織中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α表達(dá)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，Nic可明顯改善碘乙酸鈉（monosodium iodoacetate，MIA）誘導(dǎo)的OA 模型小鼠的膝關(guān)節(jié)退變，減少關(guān)節(jié)軟骨退變及周圍滑膜增生，其機制與Nic激活α7-nAChR通過磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路調(diào)控巨噬細(xì)胞功能有關(guān)［10］，表明α7-nAChR 在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和OA 中皆發(fā)揮重要作用。但激活α7-nAChR 能否對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響尚無此類報道。本研究通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA 建立小鼠OA 模型，旨在探討激活α7-nAChR 對OA 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

MIA、Nic 和α7-nAChR 特異性拮抗劑甲基牛扁堿（methyllycaconitine，MLA）（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Von Frey纖維絲（Woodland Hills公司，美國）；B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體（1∶1 000）、Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bax）抗體（1∶1 000）、活性含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（cleaved caspas-9）抗體（1∶1 000）和caspas-9抗體（1∶1 000）（Cell Signaling Technology公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與模型制備

40 只C57BL/6J 雄性小鼠購于南京醫(yī)科大學(xué)動物中心，10～12周齡，體重24～28 g。實驗前，將動物置于實驗環(huán)境中適應(yīng)3 d。根據(jù)前期研究Nic、MIA和MLA的有效劑量［10］，我們將小鼠隨機分為以下5組：對照（control）組、MIA 模型組（每只小鼠左后腿膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射MIA 0.1 mg，體積為10 μL）、MIA+Nic（0.5 mg/kg）治療組、MIA+Nic（1.0 mg/kg）治療組和MIA+Nic（1.0 mg/kg）+MLA（1.0 mg/kg）治療組，每組8 只小鼠。在MIA+Nic 治療組中，小鼠在造模前連續(xù)腹腔注射0.5或1.0 mg/kg Nic 1周，每天1次，第7天時，給予Nic 后30 min，向小鼠的左后腿膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.1 mg MIA，第28 天處死小鼠。在MIA+Nic+MLA 治療組中，小鼠在造模前除提前1 h 腹腔注射1.0 mg/kg Nic外，還提前30 min腹腔注射1.0 mg/kg的MLA。對照組小鼠和MIA 模型組小鼠同期腹腔注射等體積的生理鹽水。第28天小鼠處死后，取左后膝關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本進行實驗。上述操作程序均嚴(yán)格按照國際疼痛研究協(xié)會倫理委員會的規(guī)章、實驗室動物管理和使用指南（中國科學(xué)技術(shù)部）的規(guī)定執(zhí)行。所有動物實驗均經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)，旨在最大程度地減少痛苦并減少所用動物的數(shù)量。

1.2.2 小鼠行為學(xué)檢測

在進行基線測試之前，將小鼠置于測試環(huán)境至少3 d 以適應(yīng)測試環(huán)境。使用Von Frey 纖維絲測定小鼠后爪機械縮足反射潛伏期閾值，用以評價小鼠的疼痛行為。測試時，首先將小鼠放入金屬網(wǎng)地板的盒子中，使其適應(yīng)30 min。將標(biāo)準(zhǔn)的Von Fery 纖維絲（0.008 g、0.02 g、0.04 g、0.07 g、0.16 g、0.4 g、0.6 g、1.0 g、1.4 g和2.0 g）刺激小鼠左后爪的足底表面，直到纖維彎曲，記錄所用Von Fery纖維絲提供的刺激力。對每只小鼠進行3 次測試，計算測量閾值的平均值。當(dāng)小鼠表現(xiàn)出對≤0.4 g 的刺激有反應(yīng)時，則判定為異常，正常小鼠的閾值在1～2 g［10］。

1.2.3 組織學(xué)分析

新鮮獲得的整個小鼠左后膝關(guān)節(jié)迅速固定在4%多聚甲醛中，常規(guī)脫鈣、脫水后用石蠟包埋固定。標(biāo)本切片、脫蠟后，分別用甲苯胺藍(lán)染色和番紅固綠染色。

甲苯胺藍(lán)染色時，標(biāo)本先用甲苯胺藍(lán)溶液浸泡30 min，清洗后置于冰醋酸溶液中，蒸餾水清洗2次，隨后逐級乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。由兩位病理學(xué)醫(yī)師依據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)在光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨病變、軟骨下糖胺聚糖改變并對甲苯胺藍(lán)染色標(biāo)本進行評分，取兩者平均分為最后得分。

番紅固綠染色時，標(biāo)本用l%番紅染液浸染3 min，1%固綠復(fù)染3 min，95%酒精分化數(shù)秒，復(fù)加番紅染色2 min，鏡下95%酒精分化數(shù)秒，隨后逐級乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨退變評分和蛋白聚糖損失評分標(biāo)準(zhǔn)分別在光學(xué)顯微鏡下觀察軟骨病變［11-12］，對番紅固綠染色標(biāo)本評分，取兩者平均分為最后得分。

1.2.4 石蠟切片熒光TUNEL實驗

試劑盒采用Fluorescein（FITC）Tunel Cell Apoptosis Detection Kit（G1501-50T，Servicebio 公司，美國），按試劑盒說明書應(yīng)用TUNEL 染色評估凋亡細(xì)胞數(shù)量。依次將石蠟切片脫蠟水洗后，用蛋白酶K工作液覆蓋組織，然后用PBS（pH7.4）在脫色搖床上晃動洗滌3 次，每次5 min，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織。按片子數(shù)量和組織大小取TUNEL 試劑盒內(nèi)適量試劑1（TdT）和試劑2（dUTP）按1∶9混合，覆蓋組織。隨后將切片平放于濕盒內(nèi)。細(xì)胞核加DAPI 染液復(fù)染后封片，倒置熒光顯微鏡（Eclipse Ti-SR，Nikon 公司，日本）下觀察細(xì)胞并采集圖像，并通過HALO 軟件計算出TUNEL陽性細(xì)胞的百分比［13-14］。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

取出小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，蛋白提取試劑盒提取蛋白，并測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉中凝膠電泳，4 ℃100 V 轉(zhuǎn)移1.5 h至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉溶液在室溫下封閉1 h，然后加入相應(yīng)一抗Bcl-2、Bax、cleaved caspase-9和caspase-9，4 ℃孵育過夜。第2天洗膜后，與相應(yīng)二抗在常溫下孵育1 h。顯色、成像，并使用Image J（2.0）分析軟件對條帶灰度分析，計算蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nic對OA模型小鼠關(guān)節(jié)疼痛的影響

如圖1 所示，MIA 給藥后1～3 周，小鼠的運動功能受到明顯影響，引起機械性痛覺超敏，痛閾下降，第1 周MIA 組小鼠機械縮足反射潛伏期閾值為（0.21 ± 0.04）g，較正常對照組下降80%，持續(xù)至第3 周MIA組機械縮足反射潛伏期閾值仍較對照組下降約69%（P＜0.05）；而給予Nic 進行預(yù)處理，能顯著增加小鼠的運動功能評分，其中1.0 mg/kg Nic 較0.5 mg/kg Nic效果更為明顯，Nic預(yù)處理21 d后，小鼠機械縮足反射潛伏期閾值可恢復(fù)至（1.08±0.09）g，接近對照組水平（P＞0.05），表明Nic能減輕MIA引起的疼痛行為。同時，選擇性的α7-nAChR 拮抗劑MLA（1.0 mg/kg）能取消Nic 對MIA 模型小鼠的鎮(zhèn)痛作用，MLA組小鼠機械縮足反射潛伏期閾值顯著下降至（0.25±0.04）g，與Nic 預(yù)處理組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明Nic 可能是通過α7-nAChR發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

圖1 Nic 對MIA 模型小鼠Von Frey 纖維絲實驗中疼痛行為的影響Figure 1 Effects of Nic treatment on pain behavior in mice subjected to MIA injection

2.2 Nic對MIA誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)軟骨退化及細(xì)胞凋亡的影響

關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.1 mg/10 μL MIA可誘發(fā)膝關(guān)節(jié)軟骨退化，甲苯胺藍(lán)和番紅固綠染色（圖2A）顯示MIA組關(guān)節(jié)軟骨淺表層纖維化，表面完整性破壞，結(jié)構(gòu)紊亂，裂隙深，可見放射帶，軟骨細(xì)胞明顯減少，潮線破壞。MIA組關(guān)節(jié)軟骨退變評分和蛋白聚糖損失評分分別為（5.33±1.19）分和（2.33±0.27）分，1 mg/kg Nic 可顯著降低關(guān)節(jié)軟骨退變評分和蛋白聚糖損失評分（P＜0.05，圖2B、C）。軟骨細(xì)胞再次清晰可辨，排列規(guī)整、致密，近似水平排列，軟骨潮線結(jié)構(gòu)恢復(fù)存在。TUNEL 熒光染色顯示MIA 可誘發(fā)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，MIA組軟骨細(xì)胞凋亡率明顯增高，達(dá)到（31.83±3.89）%，是對照組的6.58倍（P＜0.05，圖2A）。1.0 mg/kg Nic 可顯著降低軟骨細(xì)胞凋亡率（P＜0.05，圖2D），這一結(jié)果表明Nic 對MIA 誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨退變及細(xì)胞凋亡具有保護作用，而α7-nAChR 選擇性拮抗劑MLA 可抵消Nic 對軟骨細(xì)胞凋亡的保護作用，使得軟骨細(xì)胞凋亡率重新升高至（31.67±5.35）%。

圖2 Nic對MIA模型小鼠膝關(guān)節(jié)退化及軟骨細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effects of Nic on knee joint degradation and apoptosis in mice subjected to MIA injection

2.3 Nic對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 實驗結(jié)果顯示，MIA 造模小鼠關(guān)節(jié)軟骨中Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，同時Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)，cleaved caspase-9 表達(dá)增加。而Nic 治療組Bcl-2 的蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax 蛋白表達(dá)和cleaved caspase-9/caspase-9 的比率降低，α7-nAChR 特異性拮抗劑MLA可抵消Nic對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（圖3）?？紤]到caspase-9是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的重要成員。受到凋亡刺激時，線粒體釋放的細(xì)胞色素C 會結(jié)合procaspase-9/凋亡酶激活因子-1（Apaf-1）。Apaf-1 介導(dǎo)的caspase-9 激活涉及固有蛋白酶解加工，可導(dǎo)致cleaved caspase-9增加，啟動caspase 級聯(lián)，進而導(dǎo)致凋亡。因此Nic對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響可能與線粒體途徑相關(guān)［15-16］。

圖3 Nic對MIA模型小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effects of Nic on the expression of apoptosis-related proteins in mice subjected to MIA injection

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)膽堿能抗炎通路在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，感染或損傷的分子產(chǎn)物激活感覺神經(jīng)元到達(dá)迷走神經(jīng)腦干部，誘發(fā)從腦干到脾臟或其他器官的動作電位，最終導(dǎo)致T 細(xì)胞釋放乙酰膽堿，后者與α7-nAChRs結(jié)合可抑制巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的釋放［17］。α7-nAChR是近年來多種炎性疾病的研究熱點，是膽堿能抗炎通路中的關(guān)鍵分子［18］。Van Maanen 等［19］發(fā)現(xiàn)在α7-nAChR 敲除小鼠中，膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度顯著增加，滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞也明顯增多。Li等［20］研究進一步發(fā)現(xiàn)Nic干預(yù)可明顯緩解膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動物模型相關(guān)臨床和組織病理學(xué)變化，減少滑膜中CD11b 陽性巨噬細(xì)胞的數(shù)量，下調(diào)血清中巨噬細(xì)胞炎性蛋白和單核細(xì)胞趨化蛋白的表達(dá)水平，而迷走神經(jīng)切除則加重了關(guān)節(jié)炎程度，上調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白的表達(dá)水平［20-21］。以上研究證實α7-nAChR 在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的病理特點與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎接近，α7-nAChR在OA動物模型中的作用機制仍不清楚。

OA 的主要病理變化是軟骨退變，軟骨細(xì)胞合成代謝與分解代謝的動態(tài)平衡有助于維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能完整，因此軟骨細(xì)胞功能是調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定的關(guān)鍵因素之一。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)：軟骨細(xì)胞凋亡與OA 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尋找軟骨細(xì)胞凋亡調(diào)控的新靶點正成為OA 研究的熱點問題［22］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，Nic 通過激活α7-nAChR 調(diào)控細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）和p38 絲裂原活化蛋白激酶抑制脂多糖誘導(dǎo)的腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化［16］。Que 等［23］發(fā)現(xiàn)FK506在體外能抑制成纖維細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，而ERK1/2抑制劑PD98059可以抑制FK506誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡。Zhou等［24］發(fā)現(xiàn)p38在骨髓增生異常綜合征的骨髓中過度活化，并誘導(dǎo)造血干細(xì)胞凋亡，在分子水平抑制p38 MAPK 通路可以減少干細(xì)胞凋亡，并刺激體外造血祖細(xì)胞的造血作用，說明ERK1/2 和p38 絲裂原活化蛋白激酶均參與了凋亡信號通路的調(diào)控，但Nic 能否通過激活α7-nAChR對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響仍不清楚，本研究構(gòu)建了MIA 誘導(dǎo)的小鼠膝OA 模型［25］，發(fā)現(xiàn)MIA 可以明顯誘導(dǎo)小鼠膝關(guān)節(jié)疼痛，Nic 對小鼠膝關(guān)節(jié)疼痛有明顯的緩解作用，α7-nAChR 阻斷劑MLA 可以消除這種緩解作用，MIA 注射后可致小鼠膝關(guān)節(jié)面軟骨糜爛，軟骨下骨暴露，軟骨細(xì)胞顯著減少，基質(zhì)染色重度減退，關(guān)節(jié)軟骨退變評分和蛋白聚糖評分明顯升高，軟骨細(xì)胞凋亡率增加，Nic小鼠腹腔內(nèi)給藥可明顯阻斷OA病理進程，軟骨細(xì)胞凋亡率下降，α7-nAChR阻斷劑MLA可拮抗這種保護作用。

對Nic 凋亡調(diào)控機制的深入研究發(fā)現(xiàn)，MIA 可破壞軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2 的穩(wěn)態(tài)及促進cleaved caspase-9/caspase-9 比值升高，Bcl-2 通過抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放而作為一種廣泛的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，參與調(diào)節(jié)線粒體的鈣穩(wěn)態(tài)和質(zhì)子流。相反，Bax則與線粒體膜上的孔蛋白相互作用并提高線粒體細(xì)胞色素C的通透性，從而導(dǎo)致線粒體中細(xì)胞色素C的釋放和caspase的活化，導(dǎo)致凋亡［26-27］。本研究發(fā)現(xiàn)Nic 可以穩(wěn)定Bax/Bcl-2 的比例，并通過α7-nAChR 抑制caspase-9 的裂解，提示α7-nAChR 可通過抑制線粒體介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡延緩小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變，α7-nAChR可成為OA治療的新靶點。但需要注意的是，凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通路不僅包括線粒體通路，還包括死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路等，這3種凋亡途徑并非完全獨立，在某些情況下它們存在相互聯(lián)系，已有研究表明，Bcl-2 與線粒體通路及死亡受體通路均關(guān)系密切［28］，因此α7-nAChR 是否在其他凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用仍需要進一步研究。