董 倩，唐 松，徐祿江，方 真

（南京農業(yè)大學工學院，南京 210031）

0 引 言

中國是棉花種植和生產第一大國，棉稈作為主要副產物年產量達5 400多萬t[1]，目前對棉稈的處理方式多是隨意丟棄或燃燒，這造成了環(huán)境污染和資源浪費[2]。棉稈的主要組分為纖維素（32%～46%）、半纖維素（20%～28%）和木質素（17%～26%）[3]。棉稈的致密結構和復雜組分限制了其直接轉化成生物燃料和化學品的效率[4]。因此，需要對棉稈進行預處理，選擇性分離其中的木質纖維素組分，打破致密緊湊的物理屏障[5]，提高水解棉稈制備可發(fā)酵性糖的效率，為生產生物燃料和化學品提供可持續(xù)的生物基原料[6-7]，有利于促進棉稈的資源化和高值化利用。

研究表明硫酸[8-9]、硝酸[10-11]和鹽酸[12-13]等傳統(tǒng)無機酸催化預處理生物質，雖能有效分離木質纖維素組分，實現(xiàn)纖維素酶的高效水解，但對設備的耐腐蝕性要求高，且易產生發(fā)酵抑制物，不適于規(guī)模化生產[14]。目前，研究學者采用路易斯酸（如氯化鐵[15]）替代傳統(tǒng)無機酸作為催化劑用于生物質的預處理，其原因是路易斯酸溶于水后生成的水合氫離子能有效破壞木質纖維素的緊密結構，實現(xiàn)木質纖維素組分的有效分離，達到傳統(tǒng)酸預處理效果的同時還可規(guī)避對設備的腐蝕等缺點[16-17]。氯化鐵作為催化劑進行預處理能有效水解半纖維素組分，并留下更容易被酶水解的固體殘留物[18]，此外，F(xiàn)e3+離子對酶活性有積極影響[19]，常用于糖發(fā)酵培養(yǎng)基的制備[20]。Zhang等[21]利用FeCl3催化水熱預處理（160 ℃和30 min）甘蔗渣，半纖維素幾乎被完全去除，但仍含有 44%堿木質素。Chen等[22]利用 FeCl3催化水熱預處理（170 ℃和30 min）甘蔗渣、水稻秸稈和桉木，大量半纖維素被去除，但木質素無明顯變化。氯化鐵催化高溫水熱預處理能夠去除生物質中大量半纖維素，但對木質素幾乎無影響。為了提高木質素的分離，需要找到可有效替代水的溶劑。乙二醇因具有很好的木質素溶解性而被廣泛用于生物質預處理[23-24]。Wei等[25]利用酸堿催化乙二醇預處理甘蔗渣，乙二醇-鹽酸預處理能夠去除99.3%半纖維素和67.1%木質素，乙二醇-氫氧化鈉預處理去除 90.9%木質素和28.8%半纖維素。以上兩種預處理都沒有達到同時高效去除木質素和半纖維素的效果。因此，將乙二醇和氯化鐵聯(lián)合運用于生物質預處理以期達到優(yōu)勢互補，提高木質纖維素組分的分離效果。目前關于乙二醇結合氯化鐵用于預處理棉稈以提高其纖維素酶水解效率的研究鮮有報道。

本研究以棉稈為原料，探索乙二醇-氯化鐵的預處理工藝，通過正交試驗對預處理條件進行優(yōu)化，并在此基礎上優(yōu)化酶水解條件，以期實現(xiàn)棉稈的高效酶水解。通過表征分析探究乙二醇-氯化鐵預處理條件對脫除棉稈木質素和半纖維素的影響，以及預處理條件和酶水解條件對提高酶水解效率的作用機理，為棉稈的預處理提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與試劑

試驗中所用試劑：六水合氯化鐵（≥99.0%）、乙二醇（≥99.5%）、硫酸（≥98.0%）、3,5-二硝基水楊酸（≥ 95.0%）、氫氧化鈉（≥96.0%）、酒石酸鉀鈉（≥ 99.0%）、苯酚（≥99.0%）、偏亞硫酸氫鈉（≥99.0%）、檸檬酸三鈉（≥99.5%）和檸檬酸（≥90.0%）均為分析純，購買于國藥集團化學試劑有限公司（上海）；碳酸鈣（≥ 99.0%；分析純）購買于西隴化工股份有限公司（廣東佛山）；甲醇（≥99.0%）、葡萄糖（≥99.0%）、木糖（≥ 99.0%）、阿拉伯糖（≥99.0%）均為分析純，購買于阿拉丁生化股份有限公司（上海）；纖維素酶（Cellic?CTec2，SAE0020-50 mL）購買于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，根據(jù)美國國家可再生能源試驗室（US National Renewable Energy Lab，NREL）的酶活測定方法[26]進行纖維素酶活測定，纖維素濾紙酶活為166 FPU/mL。

棉稈收集于新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)巴楚縣，自然風干后（含水率 8.8%），經機械粉碎，過直徑 0.425～0.250 mm篩，密封常溫保存。棉稈含有 32.9%纖維素，16.3%半纖維素，27.8%木質素，7.4%醇溶性物質，6.7%其他物質（灰分、蠟質和可溶性糖等）。

1.2 預處理反應裝置

乙二醇-氯化鐵預處理反應裝置如圖1所示，主要有三口燒瓶、加熱套、熱電偶、冷凝器和機械攪拌器組成。

1.3 乙二醇-氯化鐵預處理方法

1.3.1 乙二醇預處理體系催化劑的選擇

采用單因素試驗研究催化劑及其濃度對棉稈組分變化的影響。準確稱取2.5 g棉稈放入100 mL西林瓶中，加入50 mL 90%乙二醇的水溶液（乙二醇與去離子水的體積比為9∶1）和 0.1 mol/L催化劑或0～0.15 mol/L 氯化鐵，混合均勻，放入滅菌鍋，升溫至 121 ℃后保持60 min，冷卻至室溫取出。用G1砂型漏斗（80～120μm孔徑）過濾，加入去離子水將固體部分洗至中性，即得預處理后棉稈樣品，真空冷凍（-48 ℃，48 h ）干燥后，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乙二醇-氯化鐵預處理正交試驗

采用正交試驗設計優(yōu)化預處理條件，確定棉稈乙二醇-氯化鐵預處理的主要因素為氯化鐵濃度、固液比、預處理時間和溫度，每個因素取 5個水平，試驗因素及水平見表1。

表1 棉稈乙二醇-氯化鐵預處理正交試驗設計Table 1 Orthogonal experimental design for ethylene glycol-ferric chloride pretreatment of cotton stalks

準確稱取不同質量（3.3～10 g）的棉稈置于三口燒瓶（500 mL）中，加入100 mL 90%乙二醇的水溶液，固液比分別達到1∶10～1∶30，加入不同濃度（0.02～0.18 mol/L）的氯化鐵。將三口燒瓶置于加熱套（ZNHW 500 mL，河南愛博特科技公司，鄭州）中進行加熱，同時利用機械攪拌（150 r/min）進行混勻，待溫度升至設定值（130～170 ℃），恒溫處理一段時間（20～60 min） 后，自然冷卻至室溫。采用真空抽濾，利用G1砂芯漏斗進行固液分離。用去離子水將固體殘渣部分洗至中性，通過真空冷凍干燥器進行干燥（-48 ℃，48 h ），密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 纖維素酶水解方法

準確稱取1.0 g預處理前后棉稈分別放入100 mL絲口瓶中，加入20 mL檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 值4.8，基質濃度5%）和不同量（1.66、4.15、6.64、8.3和12.45 FPU/g）的纖維素酶，封蓋后置于 50 ℃恒溫搖床（150 r/min）進行水解反應。分別于24、48和72 h時取樣，樣品離心（6 000 r/min，2 min），取上清液過膜（0.22μm）后，采用高效液相色譜儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測分析樣品中葡萄糖的濃度，并以此計算棉稈經纖維素酶水解的葡萄糖產率。

式（1）中，采用葡萄糖產率評估生物質樣品的纖維素酶水解效率。

1.5 檢測分析方法

根據(jù) GB 5009.3—2016標準[27]測定樣品中水分含量。根據(jù)NREL提出的生物質中抽提物[28]和碳水化合物[29]的分析方法，首先利用索氏抽提器對樣品進行醇提，再依次經過兩步酸水解、抽濾、干燥、焙燒等處理，測定生物質中的醇溶性物質和木質纖維素組分的含量。采用HPLC定量檢測樣品中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖濃度，然后計算樣品中的纖維素和半纖維素含量。其中，HPLC檢測中所用色譜柱為 Aminex HPX-87C，流動相為0.005 mol/L硫酸溶液，流動相的流速為0.6 mL/min，色譜柱箱的溫度為60 ℃。相關組分計算公式如下

式（4）中0.087為液體體積；0.9為由葡萄糖計算纖維素含量的校正因子，0.97為葡萄糖在高壓滅菌鍋中的損失校正系數(shù)。

式（5）中0.087為液體體積系數(shù)；0.88為由五碳糖（木糖和阿拉伯糖）計算半纖維素含量的校正因子，0.84、0.89分別為木糖、阿拉伯糖在高壓滅菌鍋中的損失校正系數(shù)。

式（6）中，UV-abs為樣品在198 nm波長處的平均UV-Vis吸光度；ε為生物量在特定波長的吸收能力（取55 L/g·cm）；V為液體總體積，87 mL。

預處理后固體殘渣中的纖維素、半纖維素和木質素含量同樣采用 NREL的組分分析方法[25]測定，并用于計算纖維素回收率，半纖維素和木質素的去除率。

1.6 表征分析方法

利用熱重分析儀（TGA；Pyris 1 DSC，PerKinElmer，Waltham，Massachusetts）檢測樣品的熱穩(wěn)定性。采用氮氣物理吸附-脫附儀（Nova 4200e，Quantachrome Instruments，Boynton Beach，F(xiàn)L），并結合Barrett-Emmet and Taller（BET）和Barrett-Joyner-Halenda（BJH）方法對樣品的比表面積、孔隙體積和孔半徑進行分析[30]。利用裝備有銅靶的X射線衍射儀（XRD；X’TRA，Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，Massachusetts）分析樣品的纖維素結晶度（Crystallinity of cellulose，CrI），入射波長λ=0.154 nm，掃描范圍 2θ= 5°～55°，掃描速度 2( °)/min。根據(jù)樣品的XRD曲線計算樣品的纖維素結晶度CrI[31]

式（13）中I002表示纖維素結晶區(qū)對應的衍射峰強度，其對應角度為2θ≈ 22.5°（θ是XRD圖譜上衍射角度）；Iam表示纖維素非結晶區(qū)對應的衍射峰強度，其對應角度2θ≈18.7°。

2 結果與分析

2.1 乙二醇預處理體系催化劑的選擇結果分析

在121 ℃，反應時間60 min，固液比1∶20條件下，考察了催化劑及其濃度對棉稈組分變化的影響。表2試驗結果表明，路易斯酸對木質纖維素的組分分離具有促進作用，其原因是路易斯酸溶于水產生的水合氫離子（H3O+）能夠破壞木質纖維素致密復雜的結構。相較其他路易斯酸，氯化鐵對纖維素的回收、木質素和半纖維素的去除具有較好選擇性。在乙二醇預處理中加入氯化鐵對半纖維素的去除具有顯著效果，低濃度時對木質素的去除基本無影響，這與已有研究報道一致[26]。增大氯化鐵濃度至0.07 mol/L后，木質素去除率顯著提高，其原因是氯化鐵濃度增加使溶液酸性增強，加劇了預處理反應，對木質纖維素結構的破壞程度增強，從而使木質素分離。在0.15 mol/L 氯化鐵條件下，乙二醇-氯化鐵預處理棉稈半纖維素和木質素去除率分別為 80.83%和63.74%，相較單一乙二醇的水溶液預處理，半纖維素和木質素去除率分別提高349.8%和108.0%。

表2 棉稈乙二醇預處理的催化劑選擇試驗結果Table 2 Results of catalyst selection for ethylene glycol pretreatment of cotton stalks

2.2 乙二醇-氯化鐵預處理條件的優(yōu)化

如表3所示，分別以葡萄糖產率，纖維素回收率，半纖維素和木質素去除率為指標設計正交試驗以優(yōu)化棉稈的乙二醇-氯化鐵預處理條件。試驗結果表明，纖維素回收率隨氯化鐵濃度增大而降低，這說明高濃度氯化鐵會加劇木質纖維素的解構作用，尤其當氯化鐵濃度超過 0.1 mol/L時，纖維素發(fā)生顯著降解。表4和表5分別為針對表3中半纖維素和木質素去除率的極差和方差分析，結果表明，在棉稈的乙二醇-氯化鐵預處理過程中，各因素影響半纖維素和木質素去除率的順序為：氯化鐵濃度＞固液比＞反應溫度＞反應時間。分析可知最優(yōu)的預處理條件為：氯化鐵濃度0.1 mol/L，固液比1∶15，溫度160 ℃和時間20 min。在此條件下，棉稈的纖維素回收率、半纖維素和木質素去除率分別為 79.72%、88.86%和 85.74%，棉稈纖維素含量提高133.0%，半纖維素和木質素含量分別降低67.2%和58.0%。預處理后棉稈中纖維素、半纖維素和木質素含量分別為74.12%、5.36%和11.68%。Wang等[32]對比分析了稀硫酸預處理、超聲輔助堿預處理和高溫輔助堿預處理對棉稈組分的影響，發(fā)現(xiàn)預處理后棉稈纖維素含量較低（51%～64%），且木質素含量較高（21%～32%）。Singh等[33]研究了微波輔助氯化鐵預處理棉稈，發(fā)現(xiàn)預處理后棉稈纖維素、半纖維素和木質素含量分別為 52%、16%和 12%。對比之下，本預處理方法在高效去除棉稈木質素和半纖維素的同時，可有效保留纖維素，說明乙二醇-氯化鐵預處理工藝較其他預處理方法在棉稈組分分離方面具有一定優(yōu)勢。

表3 乙二醇-氯化鐵預處理棉稈去除木質素和半纖維素的試驗結果Table 3 Experimental results of ethylene glycol-ferric chloride pretreatment for removal of lignin and hemicellulose of cotton stalks

表4 乙二醇-氯化鐵預處理正交試驗的極差分析Table 4 Range analysis of orthogonal experimental forethylene glycol-ferric chloride pretreatment

表5 乙二醇-氯化鐵預處理正交試驗的方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experimental for ethylene glycol-ferric chloride pretreatment

2.3 乙二醇-氯化鐵預處理對棉稈酶水解的影響

表3對比分析了不同乙二醇-氯化鐵預處理條件下棉稈的纖維素酶水解效率，結果表明，在0.1 mol/L氯化鐵、固液比1∶15、160 ℃和20 min條件下預處理后棉稈的葡萄糖產率達到了最高（88.45%），較未處理棉稈（11.14%）提高了694.0%倍，這說明乙二醇-氯化鐵預處理能有效提高棉稈的酶水解效率，這是因為預處理去除了棉稈中大量的木質素和半纖維素[30]。此外，為確定最優(yōu)酶水解條件，進一步考察了不同酶載量（1.66、4.15、6.64、8.3和12.45 FPU/g）和酶水解時間對預處理（0.1 mol/L氯化鐵、固液比1∶15、160 ℃和20 min）后棉稈的葡萄糖產率的影響，結果如圖2a、2b所示。由圖2a可知，酶載量從1.66增加至8.3 FPU/g，預處理后棉稈的葡萄糖產率得到顯著提高，8.3 FPU/g時達到88.5%，是1.66 FPU/g的4倍。繼續(xù)增加酶載量，預處理后棉稈的葡萄糖產率變化較小（89% ～93%），這可能是由于水解過程中參與水解的纖維素酶已經達到飽和狀態(tài)[34]。因此，最優(yōu)酶載量為8.3 FPU/g。在此基礎上，研究了不同酶水解時間對酶水解效率的影響。由圖2b可知，棉稈酶水解效率與水解時間呈正相關，并在72 h時的葡萄糖產率達到100%，遠高于水解24 h的葡萄糖產率（68%），所以最優(yōu)水解時間為72 h。

為明確乙二醇-氯化鐵預處理是如何影響，并改善棉稈酶水解效率的機制，本研究利用一系列分析儀器對預處理（0.1 mol/L氯化鐵、固液比1∶15、160 ℃和20 min；木質素和半纖維素去除率分別為88.9%和85.7%）前后棉稈的微孔特征、結晶度以及熱穩(wěn)定性等理化性質進行表征分析。

2.4 表征分析

2.4.1 BET分析

利用氮氣（N2）物理吸附-脫附儀對未預處理和最優(yōu)預處理條件下處理后的棉稈的物理特性進行測定，分析結果見表6。由數(shù)據(jù)可知預處理后棉稈比表面積、孔容和孔半徑均有不同程度的增大，這意味著棉稈與纖維素酶或其他微生物的可接觸面積增大，這有利于后續(xù)的纖維素酶水解和發(fā)酵。

表6 預處理前后棉稈的物理化學特性變化Table 6 Physicochemical properties of untreated and pretreated cotton stalks

2.4.2 XRD分析

利用X射線衍射儀對預處理前后的棉稈進行纖維素結晶度分析，衍射圖譜見圖3，由圖可知，在2θ≈ 22.20°和2θ≈15.40°處均出現(xiàn)了衍射峰，根據(jù)相關研究文獻可知[26]，2θ≈ 22.20°處是纖維素 I結晶區(qū)的特征峰，2θ≈ 15.40°處是纖維素I無定形區(qū)的特征峰。由計算公式（13）算出未處理和預處理后棉稈的結晶度分別為 45.19%和49.49%，經過預處理后棉稈的結晶度有略微升高（9.52%），推測其原因是預處理去除了部分半纖維素和木質素，使纖維素溶出部分增多，從而導致結晶度稍有升高，這一趨勢與大多數(shù)文獻報道結果一致[30,35]。

2.4.3 TGA分析

Yang等[36]研究發(fā)現(xiàn)纖維素、半纖維素和木質素降解溫度的區(qū)間分別為240～390、160～360和100～900 ℃。圖4為不同樣品經10 ℃/min加熱至600 ℃過程中的質量保留分數(shù)(ω)-溫度（Thermogravimetric analysis，TG）和質量變化速率(dm/dt)-溫度（Derivative thermogravimetric analysis，DTG）的曲線，基質最大失重速率發(fā)生在 297～372 ℃，棉稈原料在 329 ℃時失重最快，預處理后，其最大失重發(fā)生在 344 ℃。此外，在400 ℃時，棉稈原料失重 63%，預處理后，失重增加到89%，這說明預處理后棉稈的熱穩(wěn)定性顯著降低。

綜上所述，棉稈經乙二醇-氯化鐵預處理（0.1 mol/L氯化鐵，160 ℃和20 min）后，去除大量木質素（85.74%）和半纖維素（88.86%），葡萄糖產率提高 7.6倍，達到100%，這主要是因為乙二醇-氯化鐵預處理后，棉稈致密結構被破壞，更多的內部纖維被暴露出來，其比表面積、孔徑和孔容顯著增加，極大改善了對纖維素酶的可及性，提高了酶水解效率。預處理后棉稈的結晶度有略微升高，但對預處理效果沒有明顯影響，可能并不是影響秸稈酶水解的主要因素[30]。

3 結 論

本文研究了乙二醇-氯化鐵預處理中氯化鐵濃度、固液比、反應時間和溫度對棉稈物理特性和主要化學組分等的影響，并進一步研究了預處理條件、酶水解時間和酶載量對棉稈酶水解效率的影響，主要結論如下：

1）乙二醇-氯化鐵預處理最優(yōu)條件為0.1 mol/L 氯化鐵、90%乙二醇水溶液、固液比1∶15、160 ℃、20 min，該條件下棉稈的纖維素回收率、木質素和半纖維素去除率分別達到79.72%、85.74%和88.86%，棉稈纖維素含量提高133.0%、半纖維素和木質素含量分別降低 67.2%和58.0%。葡萄糖產率達到88.45%（酶載量8.3 FPU/g，底物濃度 5%，pH 值 4.8，溫度 50 ℃，恒溫搖床轉速150 r/min酶解48 h）相較未處理棉稈提高694.0%。

2）通過對酶水解時間和酶載量的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在 5%底物濃度，酶載量8.3 FPU/g，pH 值4.8條件下50 ℃恒溫水解72 h后，棉稈的葡萄糖產率達到100%。

3）通過BET、TGA和XRD等分析手段，對預處理前后棉稈的物理特性、結晶度和熱穩(wěn)定性進行了表征，預處理后棉稈纖維素的結晶度升高9.52%，比表面積、孔容和孔徑均有增大，熱穩(wěn)定性顯著降低，這有利于后續(xù)生物轉化利用。