彭彥昆，田文健，郭慶輝，趙鑫龍，喬 鑫

（中國農業(yè)大學工學院，國家農產品加工技術裝備研發(fā)分中心，北京 100083）

0 引 言

隨著科學技術的進步以及農業(yè)現(xiàn)代化的快速發(fā)展，農產品的生產效率不斷提高。在提高農作物產量的同時，農藥濫用的問題也隨之出現(xiàn)。過量施用農藥會導致消費者購買的農產品中的農藥殘留超標，嚴重威脅了消費者生命健康[1]。又因農藥的種類繁多，且殘留量十分微小，給檢測和監(jiān)管增加了難度，因此進行農產品中農藥殘留新檢測方法的研究具有十分重要的意義。

目前，農藥殘留檢測方法主要分為傳統(tǒng)檢測法、生物測定技術和光譜分析技術三大類[2-4]。其中，傳統(tǒng)檢測法操作難度高，操作時間長且價格較昂貴，對樣品具有一定的破壞性，無法大面積推廣應用[5-6]。拉曼光譜具有指紋效應，其光譜的譜峰反映了被測物分子的化學鍵振動與轉動信息，在物質檢測方面廣泛應用。但拉曼光譜受限于較小的拉曼散射截面，信號強度較弱，無法對農作物中的痕量殘留提供準確的檢測[7]。在粗糙貴金屬納米顆粒之間的局部等離子體共振增強和被測物分子與納米粒子之間的吸附增強的共同作用下，拉曼信號會獲得極大的增強，由此獲得的光譜被稱為表面增強拉曼光譜（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）[8-11]。同時，SERS光譜還具有檢測快速與特異性好等優(yōu)點，因此被廣泛用于蘋果中各種農藥殘留的快速檢測。Kumar等[12]采用SERS技術結合快速預處理方法，實現(xiàn)了蘋果皮中的福美雙殘留的快速檢測，最低檢測限為 2.4×10-9g/cm2，比國標規(guī)定降低了 3個數(shù)量級。Mandrile等[13]以不同尺寸的金納米顆粒為增強基底，結合SERS技術快速檢測蘋果汁中的嘧霉胺，最低檢測濃度達 5 mg/L。Tang等[14]利用非平面SERS技術，檢測蘋果中的毒死蜱和吡蟲啉農藥殘留，檢測最低濃度分別為0.01 mg/L和0.05 mg/L。Fu等[15]合成金納米棒陣列和固相萃取凈化技術快速檢測蘋果中的噻苯咪唑農藥，最低檢出限達到 0.06 mg/L。Hussain等[16]利用雙金屬核殼納米粒子做SERS基底檢測蘋果提取物中的齊拉姆，檢測限達到0.015 mg/kg。但是，為了實現(xiàn)低濃度農藥的準確檢測，一些樣本在預處理過程中會被破壞[17-18]。所以在不破壞樣本的前提下能夠滿足農藥殘留的國標檢測要求，可以通過提高增強基底的性能來實現(xiàn)。SERS增強的機理可以用電磁機理和化學機理來說明。電磁機理是占主導地位的，因為化學機理僅對單分子產生10～104倍的增強，而電磁機理則給出108甚至更多的增強[19-20]。據(jù)資料顯示[21-22]，銀納米粒子是用于拉曼信號增強的最有效金屬粒子，SERS增強因子是金納米粒子的 10～100倍。蘋果農藥多為酸性，采用銀溶膠檢測蘋果表面農藥殘留時適當控制銀溶膠的 pH值對提高檢測結果的穩(wěn)定性具有重要的意義。

本文以改進的銀溶膠為增強基底，以蘋果中的啶蟲脒農藥為研究對象，在不破壞樣本的前提下將銀溶膠滴加到蘋果上采集光譜，結合化學計量學方法[23-24]不僅滿足了國標要求的蘋果中啶蟲脒殘留檢出限要求，還實現(xiàn)了量化分析。希望通過本研究為農產品安全檢測提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

采用實驗室自行搭建的便攜式拉曼光譜系統(tǒng)[25-27]采集蘋果表面的光譜信息，激發(fā)光波長為785 nm，積分時間 2 s，激光功率 350 mW，采集范圍在 200～2 650 cm-1。

純度99.9%的啶蟲脒原藥購于阿拉丁試劑（上海）有限公司，質量分數(shù) 10%的啶蟲脒乳油購于天津華宇農藥有限公司，聚丙烯酸鈉（sodium polyacrylate，PAAS）、硝酸銀、丙酮、鹽酸羥胺、氫氧化鈉、氯化鈉購于上海源葉生物科技有限公司，純度 98%，超純水購于北京藍弋化工有限公司。

1.2 銀溶膠制備

納米銀膠體是基于 Leopold等[28]的方法，首先制備1.1×10-3mol/L硝酸銀溶液90 mL備用，然后將鹽酸羥胺與氫氧化鈉溶解于10 mL去離子水中，制備成濃度分別為1.5×10-2mol/L和3.0×10-2mol/L的混合溶液，將新鮮制備的混合溶液迅速倒入90 mL硝酸銀溶液中，并持續(xù)攪拌30 min得到灰綠色銀溶膠，最后將所得銀溶膠與等體積PAAS（0.5%）混合，得到穩(wěn)定的銀溶膠溶液，保存于4 ℃黑暗環(huán)境下。

1.3 增強基底影響因素

以氯化鈉作為增強基底的團聚劑[29]，取氯化鈉固體分別配制0.2、0.5、1.0、2.0 mol/L氯化鈉溶液50 mL，以10 mg/kg的啶蟲脒溶液為底物，用于探究增強效果的變化。同時配制40 mmol/L的硝酸溶液用于調節(jié)銀溶膠的酸堿度（pH值），用以改進銀溶膠的增強效果。

1.4 樣品制備

利用10%啶蟲脒乳油配制啶蟲脒溶液，溶液質量分數(shù)從0.5%～10.0%，共24個濃度梯度。選用24個大小質量幾乎一致的紅富士蘋果（購于北京美廉美超市），經去離子水洗滌并置于通風櫥靜置0.5 h晾干。據(jù)文獻顯示[30]，靜置晾干后，將全果浸泡于 24個濃度梯度（0.5%～10.0%）的啶蟲脒溶液5 min，然后靜置于陰涼處48 h后，果肉中農藥含量最接近全果農藥含量。該方法不僅能夠模擬農藥從表面內吸及滲透進入果皮和果肉，而且從果梗處進入較多，符合實際使用中內吸農藥從果樹枝干經營養(yǎng)運輸通道進入蘋果果實的情況[31-32]。

1.5 光譜采集

將獲得的含穩(wěn)定劑 PAAS的銀膠體溶液以2 000 r/min離心20 min，并通過超聲重新分散在1 mL母液中。在采集光譜之前，先將丙酮（10μL）滴在蘋果表面上，以使農藥分子與果皮基質分離，然后加入5μL銀膠體，再迅速加入適量硝酸溶液和氯化鈉溶液，室溫下利用實驗室自行搭建的便攜式拉曼檢測系統(tǒng)采集蘋果的拉曼光譜曲線。每個蘋果在蘋果表面采集均勻分布的 15個點，其中蘋果果梗、花萼及最大圓周處各采集5個點，每個點采集 6次，通過對光譜進行平均處理得到的平均光譜作為樣品原始光譜。

1.6 氣相色譜法檢測蘋果農藥含量測試

將采集光譜后的蘋果迅速放入密封袋中，參照國家標準方法GB/T 5009.110—2003和GB/T 5009.146—2008，采用氣相色譜法對蘋果中啶蟲脒含量進行檢測。

1.7 拉曼光譜分析

拉曼光譜信號采集的過程中，由于外界環(huán)境和系統(tǒng)自身的穩(wěn)定性等方面因素的影響，使采集的光譜除了樣品自身有用信息外，還包含了其他無關的信息和噪聲。因此，為了消除這些無關信息和噪聲，保證光譜和農藥濃度之間具有良好的相關性，需要對原始光譜進行預處理。本研究基于蟻群算法改進的拉曼特征尋峰方法，將多次采集的梯度濃度范圍的農藥拉曼光譜進行統(tǒng)計分析，用于特征峰識別定性農藥種類，便于去除無關的光譜信息。還有基于卡爾曼濾波器的卡爾曼平滑算法，不要求信號和噪聲都是平穩(wěn)的，通過前向遞進和后向遞進的方法得誤差最小即最優(yōu)估計的真實值，從而最大程度上去除光譜信號的噪聲，提高分析精度。非對稱重加權懲罰最小二乘法（asymmetrically reweighted Penalized Least Squares，arPLS）能自動擬合并去除光譜基線和校正拉曼特征峰值。擴展乘性散射校正（Extended Multiplicative Signal Correction，EMSC）用于光譜散射校正結合偏最小二乘回歸算法（Partial Least Squares Regression，PLSR）建立定量預測模型，能提高模型精度。比較校正集的相關系數(shù)（correlation coefficient，Rc）與預測集的相關系數(shù)（prediction coefficient，Rp）、校正均方根誤差（Root Mean Square Errors of calibration，RMSEc）和預測均方根誤差（Root Mean Square Error of predictions，RMSEp）來評價模型。

2 結果與分析

2.1 銀溶膠SERS基底的表征

用紫外分光光度計對銀溶膠的紫外吸收光譜進行表征，如圖1所示，在416 nm處觀察到了明顯的銀納米粒子等離子體共振吸收峰，吸收峰為窄峰，說明制備的銀溶膠為單分散系，較多分散系溶膠，粒子均一性更好。

2.2 農藥和蘋果譜帶歸屬

由于拉曼光譜的峰位反映物質化學鍵的振動或轉動頻率，因此不同位置的拉曼峰可代表不同化學鍵，反映分子的結構信息，從而通過拉曼光譜可以確定分子的結構，同樣分子的化學鍵等結構信息也表現(xiàn)在拉曼光譜上。通過在蘋果上滴加銀溶膠分別采集不含農藥的洗凈蘋果和含國標限濃度0.8 mg/kg啶蟲脒的蘋果的SERS光譜以及啶蟲脒原藥的拉曼光譜如圖2所示。從圖2的數(shù)據(jù)可見，無農藥蘋果樣品的拉曼光譜曲線沒有明顯的拉曼峰。啶蟲脒農藥拉曼峰主要在634 cm-1，842 cm-1，1 114 cm-1，1 294 cm-1和2 196 cm-1處出現(xiàn)，分別對應C—Cl伸縮、環(huán)振動和環(huán)“呼吸”、環(huán)伸縮和C=N伸縮譜帶。含啶蟲脒農藥的蘋果樣品的SERS光譜拉曼峰主要在627 cm-1，835 cm-1和1 107 cm-1處出現(xiàn)，分別是Cl伸縮、環(huán)“呼吸”和環(huán)伸縮譜帶[8]。因為不同譜帶的化學鍵類型和結構不同，銀溶膠 SERS基底的增強作用也不同，627 cm-1，835 cm-1和1 107 cm-1處拉曼特征峰最能代表啶蟲脒農藥SERS光譜信息。

2.3 pH值對銀膠體的影響

采用銀膠體對蘋果表面農藥進行增強時，由于其pH值不同，增強效果也不同，蘋果表面啶蟲脒農藥本身呈現(xiàn)弱酸性，若采用堿性銀膠體，酸性農藥在堿性環(huán)境下可能會發(fā)生化學反應。因此有必要試驗不同pH值的銀膠體對增強效果的影響。試驗過程采用1 mol/L的NaCl作為團聚劑，通過配制的40 mmol/L的硝酸溶液去改變銀膠體的pH值，并用pH計控制，得到pH值分別從2.5～7的不同酸堿度的增強基底，并用這些基底去測試相同的10 mg/kg的啶蟲脒溶液，結果如圖3所示，整體趨勢是增強基底的增強效果隨著pH值的減小而減弱。這是因為用鹽酸羥胺與NaOH制成的銀膠粒子表面有偶電層（Ag+為負吸附質），H+被靜電力吸引聚集在表面等離子共振體上，搶占了啶蟲脒分子的活性熱點。隨著pH值下降，H+增多，銀溶膠的增強效果會大大下降。但是pH值為7時，相比于pH值為6.5，增強效果變低。這是因為啶蟲脒農藥本身是呈弱酸性的，只有在這種條件下啶蟲脒分子能夠盡可能的吸附到銀溶膠粒子上，而pH值為7時啶蟲脒已經消耗掉一些，所以反而增強效果沒有 pH值為6.5時的好。從圖3中可以看出，當pH值為6.5時，檢測效果較好。

2.4 NaCl團聚劑對銀膠體的影響

表面增強效應因金屬納米粒子和不同待測分子的電荷屬性和結合程度之間的差異，導致吸附程度的不同給拉曼光譜進行低濃度物質的分析帶來挑戰(zhàn)。在不加入團聚劑時，僅僅依靠 Ag+的電化學性質和結構特征進行增強，針對蘋果表面啶蟲脒檢測限較高，不能滿足檢測要求。因此向銀溶膠中引入電解質作為團聚劑可以改善表面增強的效果[33]。通過向銀溶膠中引入團聚劑NaCl，加快結合速度來改善銀溶膠增強效果。使用NaCl作為團聚劑是因為銀溶膠屬于惰性溶膠，對電解質比較敏感，膠粒的穩(wěn)定性完全靠吸附保護劑和建立雙電子層來維持。當體系中加入電解質會破壞電荷平衡，從而導致粒子聚沉。適當?shù)囊腚娊赓|可以使粒子聚集，快速創(chuàng)造更多的活性熱點，提高增強效果。同時啶蟲脒表面的Cl原子易發(fā)生拉電子效應，CN和CN發(fā)生共軛誘導效應，故帶有一定的負電荷。而在酸性條件下溶膠粒子表面正電荷居多，使啶蟲脒分子更容易接近銀溶膠。但是過量的Cl-引入會使粒子聚集越來越大，反而使活性熱點減少，最后聚沉，正如圖4中數(shù)據(jù)可見，NaCl溶液濃度從0上升到1 mol/L時啶蟲脒的光譜也隨之增強，而NaCl溶液濃度為2 mol/L時卻會引發(fā)聚沉，增強效果大打折扣，因此當NaCl溶液濃度為1 mol/L時，檢測效果最好。

在確定合適NaCl（1 mol/L）濃度后，向25μL銀溶膠中加入體積為5、10、15、20和25μL的1 mol/L NaCl溶液采集10 mg/kg啶蟲脒溶液SERS光譜來探究NaCl溶液與銀溶膠比例對啶蟲脒檢測的影響。如圖5中數(shù)據(jù)可見，當1 mol/LNaCl溶液加入量超過5μL時，增強效果開始下降。所以選取1 mol/L NaCl溶液與銀溶膠按照 1∶5的比例混合能有效的提高啶蟲脒檢測效果。

2.5 改進的銀溶膠的穩(wěn)定性研究

為了評估按照上述方法改進后的銀溶膠對啶蟲脒的增強效果的穩(wěn)定性，采用改進的銀溶膠與原始銀溶膠分別對10 mg/kg啶蟲脒溶液采集20次SERS光譜。結果如圖6所示，使用改進后的銀溶膠對同樣濃度的啶蟲脒檢測時拉曼信號更好。對比了627，835和1 107 cm-13個特征峰強度在兩種銀溶膠增強效果如表1所示，使用改進后的銀溶膠的特征峰離散程度更小，分布更為集中。而且通過提取并計算 3個特征峰強度值的變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)在使用改進的銀溶膠后 3個特征峰強度值的變異系數(shù)均有明顯降低，特別是在1 107 cm-1處較為明顯。經過綜合分析表明，使用了改進的銀溶膠后，對于啶蟲脒的SERS光譜穩(wěn)定性有了明顯的提升，有利于進一步進行蘋果中啶蟲脒農藥殘留的定量分析。

表1 啶蟲脒表面增強拉曼特征峰值強度及變異系數(shù)Table 1 Coefficient of variation of SERS characteristic peaks intensity of acetamiprid

2.6 蘋果中啶蟲脒殘留的定量分析

2.6.1 重復性試驗

取30個蘋果，用20 mg/kg的啶蟲脒溶液在相同條件下制備，調整銀膠體pH值為6.5并采用1 mol/L的NaCl溶液作為團聚劑進行試驗，采集蘋果表面SERS光譜后經熒光背景扣除后，計算啶蟲脒SERS光譜在627，835和1 107 cm-1處的特征峰強度的相對標準偏差分別為6.14%、6.83%、6.99%，表明該測試方法的重復性良好，能夠用于定量分析。

2.6.2 確定最低檢出限

取24個蘋果，分別配制了0.012～10.830 mg/kg的24個濃度梯度用于制備蘋果樣本，采集其SERS光譜，經基線扣除和尋峰算法處理，結果如圖7所示。

由于尋峰算法是基于特征峰數(shù)量最小為2以及3倍噪音原理，所以在此方法下啶蟲脒的最低檢出限可以達到 0.035 mg/kg，遠低于國家標準允許最大檢出限0.8 mg/kg[34]，較原始銀溶膠最低檢出限0.15 mg/kg也有降低[8]。

2.6.3 建立定量預測模型

選取24個蘋果在檢測范圍內配制0.082～3.830 mg/kg不同濃度啶蟲脒農藥，在采集完SERS光譜后，在濃度梯度范圍內均勻選取18個蘋果做校正集，6個蘋果做驗證集。由于采集到的蘋果拉曼光譜包含熒光噪音信號，因此需要對數(shù)據(jù)進行預處理，在不改變光譜性質的情況下消除噪音信號，本文比較了在PLSR算法下不同預處理方式的建模效果，發(fā)現(xiàn)卡爾曼平滑+擴展乘性散射校正+基線扣除的組合預處理效果較優(yōu)，Rp達到了0.935，RMSEP為0.067 2 mg/kg，如表2所示?；谳^優(yōu)的預處理方法分別用PLSR和MLR建模，比對建模效果。同時也對啶蟲脒的拉曼特征峰建模效果進行比對，結果如表3所示，PLSR（Partial Least Squares Regression）建模效果要優(yōu)于MLR（Multiple Linear Regression），并且考慮到至少需要2個特征峰來確定物質的存在，對627 cm-1和835 cm-12個特征峰建模的效果要優(yōu)于對 627 cm-1，835 cm-1和1 107 cm-13個特征峰，相關系數(shù)Rp達到了0.974。

表2 啶蟲脒農藥不同預處理方式下的預測結果Table 2 Prediction results of different pretreatment methods of acetamiprid

表3 啶蟲脒農藥不同建模方式下的結果Table 3 Results of different modeling methods for acetamiprid

綜上，以卡爾曼平滑+擴展乘性散射校正+基線扣除的組合做預處理，選擇627 cm-1，835 cm-1處的特征峰拉曼強度建立的偏最小二乘回歸預測模型效果較佳，校正集相關系數(shù)Rc為 0.986，校正集均方根誤差 RMSEc為0.0369 mg/kg，驗證集相關系數(shù)Rp為0.974，校正集均方根誤差RMSEp為0.044 1 mg/kg。可以很好地實現(xiàn)對蘋果中啶蟲脒殘留的準確檢測，為農產品中農藥殘留檢測提供了一條新的分析途徑。

3 結 論

利用 SERS技術結合化學計量學方法實現(xiàn)蘋果中啶蟲脒殘留的準確檢測。

1）本文通過控制銀溶膠pH值為6.5，調整農藥在銀膠體粒子表面吸附狀態(tài)，使得檢測效果更好。

2）探索了團聚劑與銀溶膠 1∶5的比例向銀溶膠中加入1 mol/L NaCl溶液，可以促進啶蟲脒分子與銀溶膠吸附，提高拉曼信號的同時，降低了啶蟲脒在蘋果中的最低檢出限以及提高檢測精確度。

3）本文的研究方法在蘋果無需前處理是情況下，對蘋果中啶蟲脒最低檢出限可達0.035 mg/kg，低于國家規(guī)定的農作物農藥最大殘留限。

4）啶蟲脒殘留的量化分析通過利用卡爾曼平滑結合擴展乘性散射校正和基線扣除法作為預處理方法，選取627，835 cm-1處的特征峰強度來建立偏最小二乘回歸模型。優(yōu)化模型的預測相關系數(shù)Rp為0.974，分析誤差達到RMSEp為0.044 1 mg/kg。由此可知，SERS結合化學計量學方法可以很好地實現(xiàn)蘋果中啶蟲脒殘留的準確檢測。