林慧敏，任強(qiáng)強(qiáng)，許 文，3，黃鳴清，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州350108；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122；3.福建省中藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122）

八珍方為中醫(yī)傳統(tǒng)方劑，最早記載于明代陳實(shí)功《外科正宗》中，為清朝宮廷補(bǔ)益之成方，有健脾和胃、益氣生血、肥兒消疳等功能。本方主要由參苓白術(shù)散加減而成，方中黨參健脾益肺，養(yǎng)血生津；山楂配伍麥芽，行氣消食、化濁降脂；薏苡仁配伍白扁豆，利水滲濕、健脾止瀉；山藥、芡實(shí)和蓮子配伍，補(bǔ)脾養(yǎng)胃、益腎固精；茯苓配伍白術(shù)，健脾益氣、利水滲濕；蓮子配伍茯苓，亦有寧心安神的功效。組方配伍合理，平和溫補(bǔ)，不寒不熱，可治療因脾胃虛弱所致的食少難消、腹痛便溏、面黃肌瘦，具有補(bǔ)而不滯、燥而兼潤(rùn)、補(bǔ)而不膩之特點(diǎn)［1］。臨床研究表明，該方對(duì)幼老體弱及病后體虛、脾胃虛弱的患者尤為有效［2］；可治療脾虛型小兒營(yíng)養(yǎng)不良，具有補(bǔ)虛消積之功［3］；可改善食欲不振，胃納減少的兒童脾虛厭食癥狀［4-5］，亦可治療小兒疳積［6］。藥理研究表明，該方具有增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)，調(diào)節(jié)胃酸pH值，促進(jìn)膽汁分泌，增加抗疲勞及耐缺氧能力的作用［1］。

八珍方現(xiàn)代研究多集中于臨床及藥理研究，化學(xué)成分研究?jī)H表明此方中含有較多的人體必需微量元素［4，7］，不足以達(dá)到對(duì)該復(fù)方進(jìn)行綜合質(zhì)量控制的目的。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-四級(jí)桿／靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，根據(jù)對(duì)照品化合物質(zhì)譜的碎片離子信息，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的裂解規(guī)律，對(duì)八珍方中化學(xué)成分進(jìn)行鑒定分析，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)闡明以及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent technologies公司）；BSA124S-CW型十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；PS-60AL臺(tái)式超聲波清洗器（深圳市雷德邦電子有限公司）；JXFSTPRP-24型研磨儀（上海凈信科技有限公司）；Heraeus Fresco17離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；明澈D24 UV純水儀（美國(guó)Merck Millipore公司）。

1.2 試藥 甲醇、乙腈（LC-MS級(jí)，德國(guó)默克公司）；甲酸、乙酸銨（LC-MS級(jí)，德國(guó)默克公司）；水為超純水（Merck Millipore公司）；內(nèi)標(biāo)：L-2-氯苯丙氨酸（批號(hào)：103616-89-3，純度≥98%，上海恒柏生物科技有限公司）；對(duì)照品：阿魏酸、紫鉚素、兒茶素、鞣花酸、牡荊素、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、原兒茶醛、沒(méi)食子酸、咖啡酸、沒(méi)食子酸乙酯、芹菜素、千層紙素A、山奈酚、木犀草素、槲皮素、苔黑酚葡萄糖苷、1-咖啡?？鼘幩?、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蔓荊子黃素、根皮苷、木犀草苷、槲皮苷、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、蘆丁、水仙苷購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，供定性鑒定用；八珍方中藥流浸膏來(lái)源于國(guó)藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 UPLC分析色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；正離子模式：流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），負(fù)離子模式：流動(dòng)相為5 mmol／L乙酸銨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序均為（0～1.0 min，1%B；1.0～8.0 min，1%B～99%B；8.0～10.0 min，99%B；10.0～10.1 min，99%B～1%B；10.1～12.0 min，1%B）；流速：0.5 mL／min；進(jìn)樣量：1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件Q-Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜采用電噴霧離子源正、負(fù)離子兩種模式。噴涂電壓：3.8 kV（正離子模式）和3.1 kV（負(fù)離子模式），毛細(xì)管溫度：320℃，鞘氣流速（Arb）：45 psi，輔助氣體流量（Arb）：15 psi，一級(jí)質(zhì)譜分辨率（Full ms resolution）：70 000，二級(jí)質(zhì)譜（MS／MS）分辨率：17 500，質(zhì)荷比窗口寬度（TopN）：3，碰撞能梯度（NCE模式）：20、40、60 eV，掃描速率：7 Hz。質(zhì)譜測(cè)定數(shù)據(jù)采用全掃描模式采集，數(shù)據(jù)采集范圍m／z 70～1 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品：阿魏酸、紫鉚素、兒茶素、鞣花酸、牡荊素、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、原兒茶醛、沒(méi)食子酸、咖啡酸、沒(méi)食子酸乙酯、芹菜素、千層紙素A、山奈酚、木犀草素、槲皮素、苔黑酚葡萄糖苷、1-咖啡酰奎寧酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蔓荊子黃素、根皮苷、木犀草苷、槲皮苷、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、蘆丁、水仙苷適量，加甲醇配置為10 μg／mL的對(duì)照品溶液供定性鑒別用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取八珍方中藥流浸膏1.0 mL，移至5 mL量瓶?jī)?nèi)，用50%甲醇水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即樣品溶液。精密移取200 μL樣品溶液至EP管中，加入2 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋混勻30 s；樣品在4℃以2 000 r／min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)。

2.3 八珍方中藥流浸膏化學(xué)成分的鑒定 八珍方中藥流浸膏供試品溶液在“2.1”項(xiàng)色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析，UPLC-Q-Exactive四級(jí)桿軌道阱高分辨率質(zhì)譜正負(fù)離子模式下的總離子流圖見(jiàn)圖1、圖2?；瘜W(xué)成分的鑒定方法：首先，根據(jù)供試品的高分辨率質(zhì)譜總離子流色譜峰，提取化合物精確分子質(zhì)量信息，運(yùn)用Xcalibur 3.0軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）在質(zhì)量偏差小于5 ppm的范圍內(nèi)計(jì)算其可能的元素組成。其次，以一級(jí)質(zhì)譜獲取的分子離子峰作為母離子，進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（CID）二級(jí)質(zhì)譜分析，獲得相應(yīng)化合物的碎片離子。根據(jù)化合物的質(zhì)譜裂解途徑，結(jié)合對(duì)照品和相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，最終鑒定化合物91個(gè)，其中33個(gè)化合物經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)確定，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 八珍方中藥流浸膏樣品UHPLC-Q Exactive軌道肼高分辨質(zhì)譜的正離子流圖

圖2 八珍方中藥流浸膏樣品UHPLC-Q Exactive軌道肼高分辨質(zhì)譜的負(fù)離子流圖

2.3.1 有機(jī)酸和酚酸類 由表1可見(jiàn)，共鑒定有機(jī)酸和酚酸類11種。現(xiàn)以綠原酸為例，根據(jù)多級(jí)碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏酚酸類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。在所建立的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中綠原酸的分子式為C16H18O9，通過(guò)Compass Isotope Pattern模擬軟件計(jì)算其負(fù)離子模式下精確分子質(zhì)量為353.087 3［M-H］-。一級(jí)質(zhì)譜在負(fù)離子模式下給出分子離子峰為m／z 353.087 7［M-H］-，質(zhì)量偏差Error為1.18 ppm，故初步推測(cè)其為綠原酸或其異構(gòu)體。

表1 八珍方中藥流浸膏化學(xué)成分鑒定

該分子離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，獲得的二級(jí)碎片離子有m／z 191、179、173、161、135，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和二級(jí)碎片信息，推斷m／z 191離子碎片是由母離子m／z 353.087 7［M-H］-失去一個(gè)咖啡?；?，m／z 173離子碎片是由m／z 191進(jìn)一步失去一分 子H2O所 致。m／z 179離 子 碎 片 由 母 離 子m／z 353.087 7［M-H］-失去一個(gè)奎寧?；?，而m／z161和m／z 135離子碎片是由m／z 179分別進(jìn)一步失去一分子H2O和CO2所致。其質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖3，并且其色譜保留時(shí)間、分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片與綠原酸對(duì)照品完全一致。綜上，該化合物結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)［21］進(jìn)行比對(duì)，鑒定為綠原酸。

圖3 酚類裂解途徑（以綠原酸為例）

續(xù)表1

2.3.2 黃酮類 由表1可見(jiàn)，共鑒定黃酮類43種?，F(xiàn)以槲皮苷為例，根據(jù)多級(jí)碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏黃酮類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。在所建立的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中槲皮苷的分子式為C21H20O11，通過(guò)Compass Isotope Pattern模擬軟件計(jì)算其負(fù)離子模式下精確分子質(zhì)量為447.092 7［M-H］-。一級(jí)質(zhì)譜在負(fù)離子模式下給出分子離子峰為m／z 447.093 6［M-H］-，質(zhì)量偏差Error為2.01 ppm，故初步推測(cè)其為槲皮苷。

該分子離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，獲得的二級(jí)碎片離子有m／z 301、300，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和二級(jí)碎片信息，推斷m／z 301離子碎片是由母離子m／z 447.093 6［M-H］-失去一分子鼠李糖基（-Rha）所致，m／z 300離子碎片是由m／z 301進(jìn)一步失去一個(gè)氫原子所致。其質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖4，并且其色譜保留時(shí)間、分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片與槲皮苷對(duì)照品完全一致。綜上，該化合物結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)［22］進(jìn)行比對(duì)，鑒定為槲皮苷。

圖4 黃酮類裂解途徑（以槲皮苷為例）

2.3.3 炔類 由表1可見(jiàn)，共鑒定炔類成分4種?，F(xiàn)以黨參炔苷為例，根據(jù)多級(jí)碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏炔類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。在所建立的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中黨參炔苷的分子式為C20H28O8，通過(guò)Compass Isotope Pattern模擬軟件計(jì)算其負(fù)離子模式下精確分子質(zhì)量為441.176 1［M+HCOO］-。一級(jí)質(zhì)譜在負(fù)離子模式下給出分子離子峰為m／z 441.176 6［M+HCOO］-，質(zhì)量偏差Error為1.17 ppm，故初步推測(cè)其為黨參炔苷。

該分子離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，獲得的二級(jí)碎片離子有m／z 305、215、185、159、179，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和二級(jí)碎片信息，推斷m／z 305離子碎片是由母離子m／z 441.1766［M+HCOO］-失去一個(gè)-C7H6基團(tuán)所致。m／z 179離子碎片是由母離子m／z 441.176 6［M+HCOO］-氧己環(huán)母核上失去-C14H16O5基團(tuán)所致。m／z 215離子碎片是由母離子失去氧己環(huán)母核-C6H12O6基團(tuán)所致，而m／z 185和m／z 159離子碎片是由m／z 215分別進(jìn)一步失去-CH2O和-C3H4O基團(tuán)所致。其質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖5，并且其色譜保留時(shí)間、分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片與綠原酸對(duì)照品完全一致。綜上，該化合物結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)［23］進(jìn)行比對(duì)，鑒定為黨參炔苷。

圖5 炔類裂解途徑（以黨參炔苷為例）

2.3.4 三萜類 由表1可見(jiàn)，共鑒定三萜類成分3種。現(xiàn)以茯苓酸B為例，根據(jù)多級(jí)碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏三萜類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。在所建立的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中茯苓酸B的分子式為C30H44O5，通過(guò)Compass Isotope Pattern模擬軟件計(jì)算其負(fù)離子模式下精確分子質(zhì)量為483.311 0［M-H］-。一級(jí)質(zhì)譜在負(fù)離子模式下給出分子離子峰為m／z 483.311 5［M-H］-，質(zhì)量偏差Error為1.09 ppm，故初步推測(cè)其為茯苓酸B。

該分子離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，獲得的二級(jí)碎片離子有m／z 465、409、365，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和二級(jí)碎片信息，推斷m／z 465離子碎片是由母離子m／z 483.311 5［M-H］-失去一分子H2O所致。m／z 409離子碎片由母離子m／z 483.311 5［M-H］-失去一個(gè)丙酸基-C3H6O2所致，而m／z 365離子碎片是由m／z 409進(jìn)一步失去一分子CO2所致。其質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖6。綜上，該化合物結(jié)合文獻(xiàn)［20］進(jìn)行比對(duì)，鑒定為茯苓酸B。

圖6 三萜類裂解途徑（以茯苓酸B為例）

2.3.5生物堿類由表1可見(jiàn)，共鑒定生物堿類成分12種?，F(xiàn)以蓮心堿為例，根據(jù)多級(jí)碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏生物堿類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。在所建立的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中蓮心堿的分子式為C37H42N2O6，通過(guò)Compass Isotope Pattern模擬軟件計(jì)算其正離子模式下精確分子質(zhì)量為611.312 1［M+H］+。一級(jí)質(zhì)譜在正離子模式下給出分子離子峰為m／z 611.310 2［M+H］+，質(zhì)量偏差Error為-3.17 ppm，故初步推測(cè)其為蓮心堿。

該分子離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，獲得的二級(jí)碎片離子有m／z 579、504、283、206、107，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和二級(jí)碎片信息，推斷m／z 579離子碎片是由母離子611.310 2［M+H］+失去一個(gè)-CH3OH基團(tuán)所致。m／z 504和m／z 107離子碎片由母離子在對(duì)甲基苯酚位置裂解所致，而m／z 283和m／z 206離子碎片是由母離子分別在碳-氧鍵和碳-碳鍵處斷裂所致。其質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖7。綜上，該化合物結(jié)合文獻(xiàn)［24］進(jìn)行比對(duì)，鑒定為蓮心堿。

圖7 生物堿類裂解途徑（以蓮心堿為例）

2.3.6 內(nèi)酯類 由表1可見(jiàn)，共鑒定內(nèi)酯類成分7種。現(xiàn)以白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?yàn)槔?，根?jù)多級(jí)碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏內(nèi)酯類成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律。在所建立的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的分子式為C15H20O2，通過(guò)Compass Isotope Pattern模擬軟件計(jì)算其正離子模式下精確分子質(zhì)量為233.154 1［M+H］+。一級(jí)質(zhì)譜在正離子模式下給出分子離子峰為m／z 233.153 5［M+H］+，質(zhì)量偏差Error為-2.44 ppm，故初步推測(cè)其為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。

該分子離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，獲得的二級(jí)碎片離子有m／z 187、159、145、131、105、91，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和二級(jí)碎片信息，推斷m／z 187峰為［M+H-CH2O2］+，m／z 159和m／z 145離子碎片是由m／z 187分別進(jìn)一步失去-C2H4和-C3H6基團(tuán)所致。m／z 187峰進(jìn)一步失去-C4H8、-C2H2和-CH2基團(tuán)，則獲取m／z 131、105和91的離子碎片，其質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖8。綜上，該化合物結(jié)合文獻(xiàn)［20］進(jìn)行比對(duì)，鑒定為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。

圖8 內(nèi)酯類裂解途徑（以白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?yàn)槔?/p>

3 討 論

Q Exactive MS系統(tǒng)具有高通量的掃描和多重檢測(cè)能力，尤為擅長(zhǎng)目標(biāo)定量實(shí)驗(yàn)?？焖俳惶娴恼?fù)極掃描模式支持最復(fù)雜的分析方法，在節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間的同時(shí)，能得到高質(zhì)量質(zhì)譜圖和化合物精確分子量，為復(fù)雜體系提供高度可靠的定性和定量測(cè)試結(jié)果，已廣泛應(yīng)用到藥物代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、中藥化學(xué)成分分析以及毒理學(xué)等研究領(lǐng)域［25］。本試驗(yàn)利用該法對(duì)八珍方中藥流浸膏中化學(xué)成分進(jìn)行分離和鑒定，通過(guò)獲得色譜峰準(zhǔn)分子離子，對(duì)八珍方中藥流浸膏進(jìn)行了化學(xué)成分分析，12 min完成化合物的分離，鑒別出91種八珍方可能含有的化學(xué)成分，包括11種有機(jī)酸和酚酸類成分、43種黃酮類、4種炔類、3種三萜類、12種生物堿類和7種內(nèi)酯類成分，其余包括內(nèi)酰胺和氨基酸類等成分。其中炔類成分主要來(lái)自黨參，三萜類主要來(lái)自茯苓，生物堿類主要來(lái)自于蓮子，內(nèi)酯類成分主要來(lái)自白術(shù)，黃酮類成分主要來(lái)自山楂和薏苡仁，所鑒別出的化合物能夠很好地表征八珍方的特征化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)利用UHPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS聯(lián)用技術(shù)，建立對(duì)八珍方中藥流浸膏化學(xué)成分快速有效的系統(tǒng)鑒定方法，對(duì)八珍方中化學(xué)成分進(jìn)行全面、快速的分析，將為控制八珍方制劑質(zhì)量及闡明其作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，并且為中藥及其復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一種快速、有效的分析方法。