陳達(dá)鑫，蔡巧燕，張 鈴，沈阿靈，褚劍鋒，朱正川，龍霖梓，熊曉滿，劉 菲，彭 軍，林 煒，林 珊*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)陳可冀學(xué)術(shù)思想傳承工作室，福建 福州350122；4.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中醫(yī)藥臨床醫(yī)學(xué)院（西苑），北京100000；5.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京100091）

原發(fā)性高血壓?。╡ssential hypertension，EH）簡稱高血壓，是目前世界上最常見的心血管疾病之一［1-2］。慢性高血壓引發(fā)的心臟、腎臟、大腦等器官損害是高血壓致死的主要病因，高血壓腎病是原發(fā)性高血壓的重要并發(fā)癥，也是引起終末期腎病的常見病因之一［3-4］。統(tǒng)計(jì)資料表明，高血壓腎臟并發(fā)癥發(fā)病率為42%，其中有18%的患者最終會出現(xiàn)腎功能衰竭。腎臟損害在維持高血壓，損害其他靶器官中具有重要的誘發(fā)作用，是高血壓過程中最重要的病理改變［5-6］。高血壓的發(fā)展伴隨全身慢性炎癥，其中各類炎癥因子的增加會誘導(dǎo)炎癥通路如NF-κB的激活［7］。清眩降壓湯是陳可冀院士從臨床實(shí)踐中總結(jié)形成的治療原發(fā)性高血壓的經(jīng)驗(yàn)方，研究表明清眩降壓湯能明顯改善高血壓病患者的臨床癥狀和生存質(zhì)量［8-9］。前期實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，清眩降壓湯在調(diào)控自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）收縮壓升高的同時也可以起到腎臟保護(hù)作用［8］。本研究在此基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究清眩降壓湯對腎臟的保護(hù)作用及其可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞4周齡清潔級SHR大鼠20只，Wistar大鼠10只，體質(zhì)量190～200 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（滬）2017-0008。委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心代購并飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（閩）2014-0006。人腎小管內(nèi)皮細(xì)胞NRK52E購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 清眩降壓湯藥物組成：苦丁茶30 g，天麻30 g，鉤藤30 g，黃芩10 g，川牛膝10 g，生杜仲10 g，夜交藤30 g，生地黃30 g，桑葉15 g，菊花15 g，均購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院。按照臨床給藥量換算為生藥量，采用水蒸氣回流法蒸煮，所得藥液減壓過濾后于蒸發(fā)皿內(nèi)蒸干，真空干燥至粉末封裝于4℃?zhèn)溆?，并用生理鹽水配制成灌胃藥液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；BCA試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）；Anti NF-κB p65、Anti phospho-NF-κB p65（美國CST公司）；GAPDH一抗、HRP二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；AngⅡ（美國Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；PBS緩沖液、青霉素和鏈霉素（美國Hyclone公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Infinite200 PRO多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；垂直電泳槽、ChemiDocXRS＋化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國BioRad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組與干預(yù) 將20只4周齡SHR大鼠隨機(jī)分為SHR組和QXJYD組，每組10只，10只Wistar大鼠組成Wistar Kyoto（WKY）組作為正常對照。QXJYD組按5 g／（kg·d）予清眩降壓湯藥液灌胃，SHR組和WKY組給予等容積生理鹽水灌胃，每日給藥1次，持續(xù)給藥8周。

2.2 動物取材 干預(yù)8周后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉動物，腹主動脈取血后立即取左側(cè)腎臟，并立即置于液氮中；血液樣本于4℃下3 000 r／min離心5 min，收集血清；血清和腎臟均放置于-80℃冰箱保存。

2.3 ELISA法檢測血清中炎癥因子 根據(jù)試劑盒說明書步驟操作，于470 nm處分別檢測白介素－6（IL-6）、白 介 素-1β（IL-1β）及 腫 瘤 壞 死 因 子-α（TNF-α）的OD值，并計(jì)算其表達(dá)。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)NRK52E細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞匯合至70%～80%時，更換無血清培養(yǎng)基進(jìn)行同步培養(yǎng)，將細(xì)胞按照設(shè)計(jì)進(jìn)行分組：Control組（空白組）、QXJYD 50 μg／mL組、QXJYD 100 μg／mL組、AngⅡ組（1×10-7mol／L）、AngⅡ＋QXJYD 50 μg／mL組、AngⅡ＋QXJYD 100 μg／mL組，干預(yù)24 h后收集細(xì)胞待檢測。

2.5 Western bolt檢測腎臟組織和NRK52E細(xì)胞中p65和p-p65蛋白表達(dá) 腎臟組織加入蛋白裂解液，使用組織研磨儀粉碎后，12 000 r／min離心20 min收集上清；NRK52E細(xì)胞干預(yù)12 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，收集細(xì)胞后加入蛋白裂解液，12 000 r／min離心20 min收集上清。使用BCA法進(jìn)行蛋白定量，100℃金屬浴變性5 min后，使用10%SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳；在冰浴下使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h，使用p65（1∶1 000）、p-p65（1∶1 000）的一抗在4℃條 件下孵育過夜，TBST洗3次，5 min／次；用HRP二抗（Rabbit，1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗3次，5 min／次。最后用ECL試劑顯影成像。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析，若方差齊，采用LSD法進(jìn)行各組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié) 果

3.1 3 組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)比較 見圖1。

圖1 3組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)比較

3.2 QXJYD對SHR大鼠腎臟組織p65磷酸化的影響Western Blot結(jié)果顯示：與對照組比較，SHR組大鼠腎臟組織的NF-κB信號通路被激活；與SHR組比較，QXJYD干預(yù)可以顯著降低p65的磷酸化水平；3組之間總p65無顯著改變。見圖2。

圖2 QXJYD對SHR大鼠腎臟組織p65磷酸化的影響

3.3 QXJYD對AngⅡ誘導(dǎo)NRK52E細(xì)胞p65磷酸化的影響 與Control組比較，單獨(dú)QXJYD 50 μg／mL干預(yù)后NRK52E細(xì)胞p65磷酸化水平下調(diào)，而QXJYD 100 μg／mL無明顯差異；AngⅡ可以顯著激活NRK52E細(xì)胞中p65的磷酸化，QXJYD可下調(diào)AngⅡ刺激所引起p65的磷酸化水平升高。見圖3。

圖3 QXJYD對AngⅡ誘導(dǎo)NRK52E細(xì)胞p65磷酸化的影響

4 討 論

高血壓屬中醫(yī)“眩暈”“頭痛”等范疇，病機(jī)多屬本虛標(biāo)實(shí)，與肝、心、腎密切相關(guān)，其前期以肝陽上亢證最為多見。中醫(yī)藥治療高血壓在病因病機(jī)和治療方面均積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，加之中藥復(fù)方具有多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的整體作用特點(diǎn)，使其在降低血壓，減少并發(fā)癥方面顯現(xiàn)出現(xiàn)代藥物所不具備的天然優(yōu)勢［10］。清眩降壓湯是陳可冀院士60余載臨床治療高血壓的經(jīng)驗(yàn)處方，針對高血壓初期階段“肝陽上亢”的證候特點(diǎn)，選用苦丁茶、天麻、鉤藤、桑葉、菊花、黃芩、夜交藤、杜仲、生地黃、川牛膝等10味藥物配伍而成，該方以清熱為主，兼以滋補(bǔ)肝腎，共奏平肝陽、清肝熱、益肝腎之功，主要適用于肝腎陰虛、肝陽上亢或陰虛上亢證的初發(fā)Ⅰ級高血壓患者（與當(dāng)代人群體質(zhì)特點(diǎn)及患高血壓的證候特征相一致），療效確切。課題組前期研究證實(shí)清眩降壓湯對SHR大鼠有顯著的血壓調(diào)控作用，同時對心、腦、腎等靶器官的器質(zhì)性損傷有較好的治療作用［11-12］。

繼發(fā)于高血壓的腎臟損害即高血壓性腎病，是高血壓病最重要的并發(fā)癥之一。高血壓病患者體內(nèi)活性氧（ROS）和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）含量明顯增高［13-14］。同時，患者體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、硫氧還蛋白過氧化物酶（TPx）和過氧化氫酶（CAT）等活性降低［15-16］。通過在腎臟固有細(xì)胞中進(jìn)行氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活多種轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB，形成腎臟炎癥狀態(tài)［17］。本研究結(jié)果表明，SHR組大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量明顯升高，表明高血壓的發(fā)生發(fā)展伴隨著全身慢性炎癥的發(fā)生，而炎癥因子浸潤腎臟后參與氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步加重腎臟炎癥。清眩降壓湯可顯著降低高血壓引起的促炎因子（IL-6、IL-1β及TNF-α）的表達(dá)升高。同時體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高血壓會引起腎臟組織及細(xì)胞中p－p65的表達(dá)升高，該現(xiàn)象被清眩降壓湯干預(yù)所抑制，結(jié)果提示清眩降壓湯防治高血壓腎損害與其抑制NFκB信號通路的活化密切相關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)了清眩降壓湯具有良好的腎臟保護(hù)作用，其主要途徑可能是通過調(diào)控NFκB通路，進(jìn)而減輕腎臟炎癥。但其如何具體影響腎臟氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。