彭雷，林英英，汪偉，姚琪，李貴森，張萍

腎病綜合征是常見的腎小球疾病，其中原發(fā)性腎病綜合征，如微小病變型腎病（minimal change disease，MCD）和膜性腎病（membranous nephropathy，MN）以足細胞損傷為主要病變，被稱為足細胞病。流行病學研究顯示足細胞病發(fā)病率高且主要累及兒童和成年男性［1］。血管生成素樣蛋白4（angiopoietinlike 4，Angptl4）是一種分泌性蛋白，屬于血管生成調(diào)節(jié)因子超家族。近年來研究表明，Angptl4廣泛參與糖代謝、脂質(zhì)代謝、動脈粥樣硬化、腫瘤生長、炎癥狀態(tài)等病理生理過程［2-3］。在MCD動物模型中，足細胞中的Angptl4蛋白表達增加，可導致蛋白尿和足細胞損傷［4-5］。但在人腎臟疾病中Angptl4與足細胞損傷及蛋白尿的關系仍不明確。本研究通過對原發(fā)性腎病綜合征患者的腎活檢組織進行Angptl4免疫熒光染色，以非足細胞損傷的系膜增生性腎小球腎炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）患者為對照，探討Angptl4與足細胞損傷及蛋白尿的關系，為尋找足細胞損傷標志物及足細胞病發(fā)病機制提供思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2020年1—6月于我院就診的初診原發(fā)性腎病綜合征患者。納入標準：年齡18~80歲，經(jīng)過常規(guī)腎臟病理檢查（包括光鏡、熒光及電鏡）及腎臟病理科醫(yī)生確診。根據(jù)病理類型分為MCD組、MN組和MsPGN組，其中MsPGN組免疫熒光染色中IgA為陰性，為非IgA型MsPGN。所有患者均完成電鏡檢查，其中MCD組及MN組于電鏡下確認存在足細胞損傷；血清肌酐正常；行腎活檢前未使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑。排除糖尿病、高血壓、自身免疫性疾病和感染性疾病，如乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病等。研究共納入31例患者，其中MN組11例，MCD組11例，MsPGN組9例。本研究經(jīng)本院倫理委員會通過并征得患者及家屬同意。

1.2 方法

1.2.1 腎組織獲取及臨床資料采集 腎組織為超聲引導下腎活檢時獲得，新鮮腎臟組織經(jīng)預處理后包埋，放入-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。分別收集患者性別、年齡、24 h尿蛋白定量、血清肌酐、血清三酰甘油（triglyceride，TG）及血清總膽固醇（total cholesterol，TC），所有臨床資料均于腎活檢前1~2 d取得。臨床資料源自四川省人民醫(yī)院腎病研究所數(shù)據(jù)庫，相關實驗室檢查由本院檢驗科完成，患者腎臟病理診斷結果由2位高年資腎臟病理醫(yī)生核查確認。

1.2.2 免疫熒光染色（單染）包埋后的腎組織用冰凍切片機MEV（德國SLEE公司）切成厚度為4μm的切片。冰凍組織切片采用間接免疫熒光方法進行染色，具體流程如下：滴加一抗孵育，置于濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜，PBS溶液清洗切片3次，每次5 min，滴加二抗孵育，避光，置于濕盒內(nèi)，在室溫下孵育1 h，避光下PBS溶液清洗切片3次，每次5 min，封片。使用一抗為山羊抗人Angptl4（1︰100，美國Santa Cruz Biotech公司）及小鼠抗人desmin（1︰100，足細胞損傷標志物，Abcam公司），二抗為Alexa Fluor 488標記的驢抗山羊抗體及Alexa Fluor 594標記的驢抗小鼠抗體（1︰400，美國Jackson Immuno Research公司）。染色后，腎臟組織切片用熒光顯微鏡BX51（日本Olympus公司）觀察，于高倍鏡、低倍鏡下拍照。同一抗體染色的所有組織曝光條件保持一致。免疫熒光圖像在Image J圖像軟件中進行統(tǒng)計。通過Image J軟件算出每個腎小球的平均熒光強度，并減去該腎小球的背景熒光強度，即為該腎小球的熒光強度。腎組織中所有腎小球熒光的平均熒光強度值即為該組織的熒光強度值。

1.2.3 免疫熒光染色（雙染）選取腎小球Angptl4陽性表達的標本進行免疫熒光雙染，分別進行如下染色：synaptopodin（足細胞標志物，紅色）+Angptl4（綠色）；CD90（系膜細胞標志物，紅色）+Angptl4（綠色）；laminin（基底膜標志物，紅色）+Angptl4（綠色）；CD31（內(nèi)皮細胞標志物，紅色）+Angptl4（綠色）。染色具體流程同免疫熒光單染。使用一抗為山羊抗人Angptl4（1︰100，美國Santa Cruz Biotech公司）、小鼠抗人synaptopodin（1︰10，德國Progen公司）、小鼠抗人laminin（1︰400，Abcam公司）、小鼠抗人CD31及小鼠抗人CD90（1︰200，Abcam公司），二抗與免疫熒光單染使用抗體相同。雙染后切片，使用激光共聚焦顯微鏡TCS SP8（德國Leica公司）觀察Angptl4與各細胞標志物的重合情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行分析。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，非正態(tài)分布計量資料以M（P25，P75）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。正態(tài)分布資料的相關性采用Pearson相關性分析，非正態(tài)分布資料的相關性采用Spearman相關性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者基線資料比較 MN、MCD及MsPGN組患者的性別比例、年齡、血清肌酐及24 h尿蛋白定量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of baseline data between the three groups表1 各組患者基線值比較

2.2 Angptl4在腎病綜合征患者腎組織中的表達情況 與MsPGN組（5.76±2.67）相比，有足細胞損傷的MN組（15.75±4.02）及MCD組（16.32±4.89）腎小球中Angptl4表達明顯增加（F=20.634，P＜0.01），見圖1。

2.3 腎小球中Angptl4與各細胞的重合情況 免疫熒光雙染可見腎小球中Angptl4與足細胞重合度最高，見圖2A；而與系膜細胞、基底膜及內(nèi)皮細胞重合度均較低，見圖2B~D。

Fig.1 Angptl4 expression increased in primary nephrotic syndrome with podocyte injury(Immunofluorescence staining,×400)圖1 Angptl4在足細胞損傷的原發(fā)性腎病綜合征中表達增加（免疫熒光染色，×400）

Fig.2 The coincidence of glomerular Angptl4 with podocytes,mesangial cells,glomerular basement membrane and endothelial cells(Immunofluorescence staining,×400)圖2 腎小球Angptl4與足細胞、系膜細胞、基底膜及內(nèi)皮細胞的重合情況（免疫熒光染色，×400）

2.4 腎小球Angptl4表達與desmin、24 h尿蛋白定量及血脂的相關性 免疫熒光染色結果顯示，與MsPGN組相比，MN組腎組織Angptl4表達明顯增加，且足細胞損傷標志物desmin表達也明顯增加，見圖3。相關性分析結果顯示，腎小球Angptl4表達（13.05±6.15）與desmin表達（10.26±5.21）、24 h尿蛋白定量［（5.63±1.80）g］呈正相關（r分別為0.953和0.530，均P＜0.05）；與血清TG［2.15（1.70，2.97）mmol/L，rs=0.097］和TC［（7.52±1.90）mmol/L，r=-0.008］水平均無線性相關（均P＞0.05）。

Fig.3 Glomerular immunofluorescence of Angptl4 and Desmin in MN and MsPGN groups(×400)圖3 MN及MsPGN組患者腎小球Angptl4與Desmin熒光染色（×400）

3 討論

3.1 Angptl4分泌引起蛋白尿和足細胞損傷 足細胞損傷是多種慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）包括MCD、MN、局灶性節(jié)段性腎小球硬化、糖尿病腎病的重要發(fā)病機制。以足細胞損傷或功能失調(diào)為主而導致蛋白尿的腎臟疾病稱為足細胞病，其在CKD中占有重要的位置［6］。足細胞損傷是導致蛋白尿及CKD發(fā)病和進展的關鍵環(huán)節(jié)。

研究表明，在MCD和MN患者腎組織中，足細胞分泌的Angptl4表達增加；在足細胞中轉(zhuǎn)入Angptl4基因的大鼠會出現(xiàn)蛋白尿并引起足細胞損傷，表明Angptl4在某些類型的腎小球疾病中介導蛋白尿的產(chǎn)生［4］。本研究顯示，與MsPGN患者相比，MCD及MN患者腎小球中的Angptl4表達明顯增高，且免疫熒光雙染顯示Angptl4表達位置與腎臟組織中足細胞位置高度重合。筆者推測增加的Angptl4可能是腎臟足細胞分泌的，這一結果與文獻結果一致［4］。本研究進一步發(fā)現(xiàn)在MCD、MN及MsPGN患者中，腎小球Angptl4的表達水平與足細胞損傷標志物desmin表達和24 h尿蛋白定量呈正相關，進一步提示在MCD及MN患者中，足細胞分泌的Angptl4可能引起蛋白尿及足細胞損傷。

3.2 Angptl4的分子形式及其介導足細胞損傷機制 Angptl4具有不同的分子形式。全長的Angptl4由前蛋白轉(zhuǎn)化酶在接頭區(qū)進行水解，釋放Angptl4的N-末端（nAngptl4）和Angptl4的C-末端（cAngptl4）；nAngptl4可以組裝成二聚體或四聚體結構，而cAngptl4為單體結構；nAngptl4及全長的Angptl4參與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，而cAngptl4不參與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)［7］。Angptl4的剪切具有組織特異性；在人體中，肝臟分泌剪切的nAngptl4，而脂肪組織分泌全長的Angptl4［8］。研究足細胞分泌的Angptl4的分子形式有助于闡明Angptl4的作用機制。本研究尚未明確足細胞分泌的Angptl4的具體分子形式，有待后續(xù)研究進一步證實。

血液循環(huán)中的Angptl4主要由肝臟分泌并參與脂質(zhì)調(diào)節(jié)［2］。在Angptl4過表達小鼠模型中血清TG水平升高，而敲除Angptl4小鼠血清TG水平下降［7］。本研究結果顯示，腎小球Angptl4的表達與血清TG和血清TC不相關，提示腎小球足細胞分泌的Angptl4與由脂肪組織和肝臟分泌的Angptl4可能有著不同的靶點及病理生理作用。已有研究顯示，Angptl4在足細胞中受活化T細胞的核因子1（nuclear factor of activation T cell 1，NFATc1）調(diào)控，表明NFATc1可能是Angptl4的上游信號通路［5］。在糖尿病腎病大鼠模型中，Angptl4可通過beta1 Integrin/FAK信號通路介導足細胞凋亡，提示beta1 Integrin/FAK可能是Angptl4的下游信號通路［9］。研究已證實足細胞損傷在MCD、MN及糖尿病腎病發(fā)病中起關鍵作用［1，10］。因此，筆者推測NFATc1可調(diào)控足細胞分泌Angptl4，進而通過beta1 Integrin/FAK信號通路參與MCD及MN發(fā)生發(fā)展，具體機制有待今后更多的研究探索及驗證。

綜上所述，本研究顯示腎小球中的Angptl4與腎病綜合征中尿蛋白的產(chǎn)生及足細胞的損傷有密切關系，提示Angptl4可能是治療足細胞疾病的一個新的靶點。