吳金環(huán)，鄭寶勇，張理濤

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見(jiàn)的炎癥性皮膚病，其主要特征為慢性濕疹皮疹和瘙癢，可能產(chǎn)生抑郁、睡眠障礙，甚至自殺意念，從而對(duì)患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響［1］。隨著中醫(yī)藥應(yīng)用的不斷完善和發(fā)展，中藥治療AD的不良反應(yīng)發(fā)生率相對(duì)較低，療效較好［2］。傳統(tǒng)藥用植物紫草具有治療陰道炎、玫瑰糠疹、急性和慢性肝炎的功效。紫草素是提取自紫草根的萘醌類化合物，具有抗炎、抗癌、抗菌等作用，可用于治療扁平疣、銀屑病，局部應(yīng)用于燒傷治療，促進(jìn)傷口愈合［3-4］。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是過(guò)敏性炎癥及輔助性T細(xì)胞（Th）2極化的重要介導(dǎo)因子，其下游因子為OX40及其配體OX40L。研究發(fā)現(xiàn)，抑制受損皮膚中TSLP、白細(xì)胞介素（IL）-4和IL-6水平可改善AD［5］。另外，Th1/Th2的平衡對(duì)2，4-二硝基氟苯（2，4-Dinitrofluorobenzene，DNFB）誘導(dǎo)的AD也有改善作用［6］。但是，目前尚鮮見(jiàn)紫草素對(duì)AD小鼠TSLP/OX40L通路及Th1/Th2平衡影響的報(bào)道，本研究旨在對(duì)此進(jìn)行觀察，為紫草素用于AD患者的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)BALB/c小鼠90只，雄性，體質(zhì)量15~20 g，6~8周齡，購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0009。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律規(guī)定，按照3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道的關(guān)懷照顧。實(shí)驗(yàn)前給予3 d適應(yīng)性飼養(yǎng)，溫度22℃，濕度55%，12 h/12 h明暗循環(huán)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 紫草素（純度98%）購(gòu)自成都普斯生物科技有限公司；潑尼松龍（5 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021207）購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 小鼠TSLP、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-4和干擾素（IFN）-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；HE染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；FIX&PREM破膜劑購(gòu)自美國(guó)Caltag公司；DNFB、十二烷基硫酸鈉（SDS）和β-actin鼠抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和BAC蛋白定量試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TSLP兔多克隆抗體（Anti-TSLP）、OX40L兔單克隆抗體（Anti-OX40L）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；酶標(biāo)儀Fax-20100購(gòu)自美國(guó)INStat公司；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海普赫生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；蛋白凝膠成像儀、轉(zhuǎn)膜儀和電泳儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 AD小鼠模型的制備與分組 參考蔣麗等［7］采用的方法并加以改進(jìn)，局部外涂DNFB制備AD小鼠模型，造模期約為25 d。待小鼠背部皮膚出現(xiàn)紅斑、水皰、部分糜爛、上覆黃色痂皮即為造模成功。將造模成功的小鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，紫草素低（20 mg/kg）、中（30 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組（潑尼松龍，10 mg/kg［8］），每組15只。另取15只作為正常對(duì)照組。各給藥組大鼠按10 mL/kg灌胃相應(yīng)藥物，模型組和正常對(duì)照組灌胃等體積溶劑（含0.5%羧甲基纖維素鈉的蒸餾水），1次/d，連續(xù)15 d。

1.2.2 觀察記錄小鼠搔抓行為及評(píng)價(jià)皮膚炎性損傷 分別于給藥后的第5、10和15天，將每只小鼠單獨(dú)放置，觀察并記錄在10 min內(nèi)小鼠搔抓背部的次數(shù)，連續(xù)搔抓算作1次；參考臨床特應(yīng)性皮炎積分（SCORAD）指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［9］，分別在給藥后第7、15天評(píng)價(jià)小鼠皮損嚴(yán)重程度。紅斑、鱗屑、水腫和表皮脫落分為無(wú)（0分）、輕（1分）、中（2分）、重（3分）4個(gè)等級(jí)。

1.2.3 HE染色觀察小鼠皮損組織病理學(xué)變化 末次給藥結(jié)束后，小鼠腹腔注射10%水合氯醛（400 mg/kg）深度麻醉，實(shí)施安樂(lè)死。收集小鼠眼眶血（外周血），置于4℃冰箱用于后續(xù)流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測(cè)。收集小鼠背部實(shí)驗(yàn)區(qū)皮損組織，每組取5只小鼠皮損組織（其余皮損組織置于-80℃冰箱中，用于后續(xù)Western blot檢測(cè)），迅速置于4%中性甲醛中固定24 h，用石蠟包埋，切片后使用HE染色試劑盒進(jìn)行染色，用中性樹(shù)膠封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠皮損組織病理變化。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血Th1/Th2細(xì)胞比例 取1.2.3中置于4℃冰箱的小鼠外周血，每組1 mL，肝素抗凝，加入RPMI 1640培養(yǎng)基［含10%胎牛血清（FBS）］混懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，然后取1 mL混懸液加入刺激劑（含100 mg/L佛波醇酯和1 mg/L離子霉素）和阻斷劑（10 mg/L布雷菲德菌素A），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，取100μL加入流式管中。于流式管中再加入5μL表面染色劑PreCP-Cy5與5μL Anti-mouse-CD4混勻，室溫避光孵育15 min，依次加入100μL FIX&PREM中的A液，室溫避光孵育15 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入50μL FIX&PREM中的B液，其中實(shí)驗(yàn)管中加雙色標(biāo)記Antimouse-IFN-γ和FITC/Anti-mouse-IL-4-PE混勻，對(duì)照管中加同型對(duì)照抗體Rat IgG1-FITC/Rat IgG1-PE混勻。室溫避光孵育20 min后，加入2 mL PBS洗滌液，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，再加入1 mL PBS洗滌液后上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)FITC-CD4熒光圈測(cè)定CD4+T細(xì)胞，計(jì)算Th1（CD4+IFN-γ+）和Th2（CD4+IL-4+）細(xì)胞百分比，并計(jì)算Th1/Th2比例。

1.2.5 ELISA檢測(cè)小鼠外周血血清中TSLP、TNF-α、IL-4和IFN-γ水平 取1.2.3中置于4℃冰箱中的小鼠外周血，每組2 mL，12 000 r/min離心10 min取血清，按照TSLP、TNF-α、IL-4和IFN-γELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達(dá)水平 取1.2.3中置于-80℃冰箱中的各組小鼠皮損組織，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、轉(zhuǎn)膜、抗體封閉。以1︰2 000稀釋后的Anti-TSLP和Anti-OX40L一抗4℃過(guò)夜孵育，置于含辣根過(guò)氧化物酶綴合的二抗（1︰5 000）中室溫孵育2 h，ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照。以β-actin為參照，分析灰度值，得出蛋白表達(dá)水平，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)小鼠搔抓行為及皮膚炎性損傷的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠搔抓行為增加，皮膚炎性損傷顯著加重（P＜0.05）；與模型組相比，紫草素低、中、高劑量組小鼠第5、10、15天的搔抓行為減少，第7、15天皮膚炎性損傷依次減輕（P＜0.05）；紫草素高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠第10、15天搔抓行為以及第15天皮膚炎性損傷程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

2.2 紫草素對(duì)小鼠皮損組織病理學(xué)的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠皮損組織中的表皮和真皮區(qū)域均有密集的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表皮增厚；與模型組相比，紫草素低、中、高劑量組小鼠皮損組織中，表皮和真皮區(qū)域炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和表皮增厚依次減輕；紫草素高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組皮損組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和表皮厚度差異不明顯。見(jiàn)圖2。

2.3 紫草素對(duì)小鼠外周血中Th1/Th2細(xì)胞比例的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠外周血中Th1細(xì)胞顯著減少，Th2細(xì)胞顯著增多，Th1/Th2比例顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，紫草素低、中、高劑量組小鼠外周血中Th1細(xì)胞依次增多，Th2細(xì)胞依次減少，Th1/Th2比例依次升高（P＜0.05），呈劑量依賴性；紫草素高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 紫草素對(duì)小鼠血清TSLP、TNF-α、IL-4和IFN-γ水平的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清TSLP、TNF-α和IL-4水平顯著升高，IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，紫草素低、中、高劑量組小鼠血清TSLP、TNF-α和IL-4依次降低，IFN-γ水平依次升高（P＜0.05）；紫草素高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組上述指標(biāo)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

Fig.2 Histopathological changes in skin lesions in each group of mice(HE staining,×200)圖2 各組小鼠皮損組織病理學(xué)變化（HE染色，×200）

Tab.2 Comparison of the ratio of Th1/Th2 cells inperipheral blood between the six groups of mice表2 各組小鼠外周血Th1/Th2細(xì)胞比例比較（n=15，x±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of TSLP,TNF-α,IL-4 and IFN-γbetween the six groups of mice表3 各組小鼠血清中TSLP、TNF-α、IL-4和IFN-γ水平比較 （n=15，ng/L，x±s）

2.5 紫草素對(duì)小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達(dá)水平的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，紫草素低、中、高劑量組小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達(dá)水平依次降低（P＜0.05）；紫草素高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠皮損組織2種蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3、表4。

Fig.3 Western blot results of TSLP and OX40L protein expression in skin lesions in each group of mice圖3 各組小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達(dá)Western blot圖

Tab.4 Comparison of TSLPand OX40Lprotein expression levels in skin lesions between the six groups of mice表4 各組小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達(dá)水平比較（n=10，x±s）

3 討論

3.1 AD小鼠模型的特征 AD是一種因皮膚屏障功能出現(xiàn)障礙而產(chǎn)生的慢性皮膚疾病，以濕疹和嚴(yán)重瘙癢等為特點(diǎn)，具有復(fù)發(fā)性［10］。隨著社會(huì)工業(yè)化的不斷發(fā)展，其發(fā)病率也在逐年升高，但病因尚不明確；其中，表皮屏障通透性增加和適應(yīng)性免疫功能障礙可能是AD產(chǎn)生的主要原因［11］。本研究通過(guò)采用局部外涂DNFB法制備AD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠皮損組織中表皮和真皮區(qū)域均有密集的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表皮增厚，搔抓行為增加，皮膚炎性損傷加重，外周血中Th2細(xì)胞、TSLP、TNF-α和IL-4水平顯著升高，Th1細(xì)胞、IFN-γ水平和Th1/Th2比例顯著下降，提示該模型構(gòu)建成功且Th1/Th2平衡遭到破壞。

3.2 紫草素對(duì)AD小鼠Th1/Th2平衡的影響 紫草素作為紫草根提取物的主要活性成分，具有顯著的抗炎作用，可抑制AD患者促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，緩解皮膚炎性損傷［12］。Lee等［13］研究發(fā)現(xiàn)，紫草素在小鼠哮喘模型中能顯著抑制過(guò)敏性炎癥和氣道高反應(yīng)性，具有治療過(guò)敏性哮喘的潛力。Dai等［14］研究發(fā)現(xiàn)，紫草素在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中能顯著抑制Th1細(xì)胞因子表達(dá)并誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子表達(dá)，從而起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，這與本研究結(jié)果并不一致。這可能是由于膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎和特應(yīng)性皮炎的進(jìn)展過(guò)程是由不同的細(xì)胞因子發(fā)揮作用，因此紫草素對(duì)兩者不同細(xì)胞因子所發(fā)揮的作用也不相同。其中，Th1型細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ及TNF-α等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫反應(yīng)，Th2型細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-3和IL-8等細(xì)胞因子，與體液免疫相關(guān)，Th1/Th2失衡可導(dǎo)致Th1型細(xì)胞功能受到抑制、Th2型細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，產(chǎn)生多種過(guò)敏性、免疫性及炎癥性疾病［15］。另外，紫草素可以延長(zhǎng)野生型小鼠移植皮的存活時(shí)間［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，紫草素能顯著抑制AD小鼠皮損組織中表皮和真皮區(qū)域炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和表皮增厚，減少小鼠搔抓行為，減輕小鼠皮膚炎性損傷程度及降低Th2細(xì)胞、TSLP、TNF-α和IL-4水平，增加Th1細(xì)胞、IFN-γ水平及Th1/Th2比例，且呈劑量依賴性，提示紫草素能夠改善AD小鼠皮膚炎性損傷，維持Th1/Th2平衡，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3.3 紫草素對(duì)AD小鼠TSLP/OX40L通路蛋白表達(dá)的影響 TSLP介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與Th2型免疫反應(yīng)的過(guò)程，且須通過(guò)介導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞表面OX40L來(lái)實(shí)現(xiàn)，激活TSLP/OX40L通路可抑制炎性細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)［17］。Feng等［18］研究發(fā)現(xiàn)，TSLP/OX40L通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+、CD25+細(xì)胞和炎性因子水平參與哮喘的發(fā)病和氣道炎癥反應(yīng)。Yao等［19］研究發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)顆粒改善免疫抑制作用的機(jī)制與樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的TSLP/OX40L通路有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，紫草素能顯著降低TSLP和OX40L蛋白表達(dá)水平，且呈劑量依賴性，提示紫草素可能通過(guò)抑制TSLP/OX40L通路，減輕AD小鼠皮損組織炎癥反應(yīng)，維持Th1/Th2平衡，修復(fù)皮膚損傷。另外，山梨葉提取物可通過(guò)抑制AD患者控制瘙癢感覺(jué)的外周神經(jīng)元中的TSLP通路發(fā)揮其止癢作用［20］；松皮提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡和皮膚屏障功能，改善DNFB誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎［21］。這與本研究中紫草素通過(guò)抑制TSLP/OX40L通路維持Th1/Th2平衡、改善小鼠AD的結(jié)果一致。

綜上所述，紫草素可劑量依賴性地維持AD小鼠外周血Th1/Th2平衡，減輕炎癥反應(yīng)，緩解皮膚損傷，其機(jī)制可能與抑制TSLP/OX40L通路有關(guān)。本研究為臨床使用紫草素治療AD提供了理論依據(jù)，但紫草素治療AD的具體作用機(jī)制尚需深入研究。