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        17β-HSD3抑制劑抗前列腺癌活性及急性毒性的研究

        2021-10-12 14:51:24韓楊包?;?/span>柏合劉潔婷孫文慧袁曉環(huán)
        天津醫(yī)藥 2021年9期
        關(guān)鍵詞:藥代雄激素前列腺癌

        韓楊,包?;?,柏合,劉潔婷,孫文慧,袁曉環(huán)△

        前列腺癌是發(fā)生在前列腺的實(shí)體惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì),2018年全球新增前列腺癌患者127.6萬(wàn)例,死亡35.9萬(wàn)例;在男性癌癥中,其發(fā)病和死亡占比分別為13.5%和6.7%,僅次于肺癌[1]。17β-羥基類固醇脫氫酶3(17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 3,17β-HSD3)是雄激素受體(androgen receptor,AR)信號(hào)通路下游的關(guān)鍵酶,在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究表明,17β-HSD3表達(dá)顯著上調(diào)能夠引起機(jī)體內(nèi)AR信號(hào)通路出現(xiàn)異常,誘導(dǎo)雄激素分泌增多,從而影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[2]。姜黃素(Cur)是傳統(tǒng)中藥姜黃的重要成分。大量臨床研究表明,Cur能夠治療多種癌癥,包括前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等[3-5]。由于Cur中存在雙酮結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其穩(wěn)定性較差、生物利用度及腸道吸收率偏低,限制了進(jìn)一步的臨床應(yīng)用[6]。本課題組前期以Cur結(jié)構(gòu)為母體設(shè)計(jì)合成了生物利用度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的一系列Cur類似物H1~H9,并篩選出17β-HSD3選擇性抑制劑H7[7]。本研究旨在觀察H7的抗前列腺癌活性,探討其誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制,考察H7的急性毒性情況,并分析其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),為開發(fā)抗前列腺癌的靶點(diǎn)藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 人雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);SPF級(jí)C57小鼠32只、SD大鼠20只,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物股份有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(遼)2015-001)。將小鼠和大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房,溫度(22±2)℃,濕度60%±5%,12 h交替照明,自由進(jìn)食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

        1.1.2 主要試劑與儀器 Cur(純度為99%)購(gòu)自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司;AR抑制劑ARN-509(純度為98%)購(gòu)自美國(guó)MCE公司;Cur類似物H7(純度99.2%)由牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心設(shè)計(jì)合成[8];胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAN公司;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;蛋白酶及磷酸酶抑制劑購(gòu)自哈爾濱新?;驒z測(cè)有限公司;RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人β-actin購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司;兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3單克隆抗體、鼠抗人AR單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;FITC偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色液購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。371 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;IX70生物顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;xCELLience RTCA DP細(xì)胞分析儀器購(gòu)自美國(guó)ACEA公司;NanoDrop 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀購(gòu)自美國(guó)GE公司;Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司;Agilent 1100高效液相色譜儀(HPLC)購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將LNCaP細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中,于37℃,5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)2 d,待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化后傳代,選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)筆者前期對(duì)各藥物濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)[7],將細(xì)胞分為4組,分別為空白對(duì)照組(Con組,不加任何藥物)、Cur組(Cur 150μmol/L)、AR抑制劑組(AR inhibitor組,AR抑制劑5μmol/L)和Cur類似物H7組(H7組,H7 150μmol/L)。

        1.2.2 xCELLience RTCA DP細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LNCaP細(xì)胞配制細(xì)胞懸液,在E-Plate 16孔板中加入50μL培養(yǎng)基測(cè)量基線,細(xì)胞懸液按照1×105個(gè)/孔接種于E-Plate 16孔板中,每孔100μL,于超凈工作臺(tái)靜置30 min后上機(jī)檢測(cè),每15 min測(cè)定1個(gè)點(diǎn),培養(yǎng)24 h,按照1.2.1實(shí)驗(yàn)分組分別在孔中加入不同藥物處理細(xì)胞,每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,保持實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),當(dāng)活細(xì)胞與電子板中的電極相互作用時(shí),自動(dòng)計(jì)算細(xì)胞指數(shù)(CI值)。

        1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LNCaP細(xì)胞,以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中12 h,按照1.2.1實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加藥,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用蛋白胰酶消化后收集細(xì)胞,離心后棄掉上清液,加入1 mL預(yù)冷PBS溶液重懸后再離心,此操作重復(fù)2次,吸棄上清液,加入1×結(jié)合緩沖液重懸后吸出100μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至4 mL培養(yǎng)管中,管中分別加入5μL PI染液和5μL FITC Annexin-V染液,室溫避光孵育15 min后加入400μL的1×結(jié)合緩沖液,流式細(xì)胞儀設(shè)置參數(shù),1 h內(nèi)檢測(cè)樣品并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

        1.2.4 Western blot檢測(cè)Caspase-3、AR蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LNCaP細(xì)胞接種于6孔板中,待12 h細(xì)胞貼壁后按照1.2.1實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加藥,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞,加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞,充分震蕩后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中,4℃,14 000×g離心10 min,收集上清液,采用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)蛋白濃度,加入上樣緩沖液,混勻后放入100℃水中使蛋白變性,10 min后冰上冷卻備用,上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,取出PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的封閉液中,室溫?fù)u床封閉1 h,TBST緩沖液洗去膜上封閉液,分別加入兔抗人Caspase-3單克隆抗體(1∶1 000)、鼠抗人AR單克隆抗體(1∶200)及β-actin抗體(1∶1 000),4℃過(guò)夜,回收一抗,TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min,分別加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)、山羊抗鼠IgG二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min,將顯影液滴到PVDF膜上,置于成像儀顯影,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶灰度值的比值表示蛋白的表達(dá)水平。

        1.2.5 H7的急性毒性實(shí)驗(yàn) 取32只C57小鼠,采用隨機(jī)數(shù)字表法分成4組,分別為空白對(duì)照組(Con組,1%CMC-Na)、Cur類似物H7高劑量組(H7,100 mg/kg)、中劑量組(H7,50 mg/kg)、低劑量組(H7,25 mg/kg),H7用1%CMC-Na溶解。每天灌胃1次,連續(xù)灌胃14 d,觀察小鼠一般行為活動(dòng)、體質(zhì)量和死亡情況。14 d后用10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉,取材,取肝臟和腎臟石蠟包埋做HE染色。

        1.2.6 HE染色觀察肝臟和腎臟組織病理學(xué)變化 取4%多聚甲醛溶液固定肝臟和腎臟組織,常規(guī)梯度脫水,石蠟包埋,使用切片機(jī)切片,切片厚度為4μm,采用HE染色法,中性樹膠封片,200倍生物顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟和腎臟組織的形態(tài)學(xué)變化情況。

        1.2.7 藥代動(dòng)力學(xué)分析 取10只SD大鼠,用5 mg/kg的H7灌胃(1%CMC-Na溶解)。用10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉,分別在給藥后5、10、15、30、60、120、240、360、480 min眼眥取血,HPLC檢測(cè)血藥濃度,方法參考文獻(xiàn)[9]。按DAS 2.1.1程序經(jīng)計(jì)算機(jī)擬合,得到H7在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),測(cè)出血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)、峰濃度(Cmax)、最高峰時(shí)間(tmax)和消除半衰期(t1/2)。

        1.2.8 檢測(cè)H7藥物組織分布 取SD雄性大鼠10只,用5 mg/kg的H7灌胃(1%CMC-Na溶解),在給藥30 min后,用10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉,大鼠窒息斷頸取材,收集腦、肝、脾、肺、小腸、胃、腎、心和睪丸。HPLC檢測(cè)藥物在各器官中濃度值。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),組間多重比較采用LSD-t法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞活性的影響 細(xì)胞鋪板24 h,各組間LNCaP細(xì)胞的CI值未出現(xiàn)顯著差異。加藥后繼續(xù)觀察48 h(共72 h),與Con組比較,Cur組、AR inhibitor組和H7組處理的LNCaP細(xì)胞的CI值均明顯下降;與Cur組和AR inhibitor組比較,H7組LNCaP細(xì)胞的CI值下降更明顯,在給藥后36 h(60 h)差值最為明顯,給藥后48 h時(shí)各組差值逐漸平穩(wěn)。見圖1。

        Fig.1 Real-time monitoring of changes in LNCaP cell activity圖1 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LNCaP細(xì)胞活性的變化

        2.2 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡率的影響 Con組、Cur組、AR inhibitor組和H7組凋亡率(%)分別為10.97±0.14、15.80±0.26、21.43±0.72和27.93±1.92(n=3,F(xiàn)=49.690)。Con組、Cur組、AR inhibitor組和H7組LNCaP細(xì)胞凋亡率依次升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

        2.3 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞的Caspase-3、AR蛋白表達(dá)水平的影響 與Con組比較,Cur組、AR inhibitor組和H7組LNCaP細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高,AR蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)。見表1,圖3、4。

        Fig.2 The effects of different drugs on LNCaP cell apoptosis rates圖2 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡率的影響

        Tab.1 Comparison of Caspase-3 and AR protein expression levels between the four groups of LNCaP cells表1 各組LNCaP細(xì)胞Caspase-3、AR蛋白表達(dá)水平比較 (n=3,x±s)

        Fig.3 Effects of different drugs on the expression levels of Caspase-3 protein in LNCaP cells圖3 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

        Fig.4 Effects of different drugs on the expression levels of AR protein in LNCaP cells圖4 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞AR蛋白表達(dá)水平影響

        2.4 H7的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 高、中、低劑量組及Con組小鼠連續(xù)灌胃14 d,未發(fā)現(xiàn)活動(dòng)增加、流涎、抽搐、昏迷、勃起、腹瀉、肌張力改變、嗜睡、過(guò)度興奮、扭體(腹部收縮)和死亡等情況。14 d后,HE染色肝臟和腎臟,高、中、低劑量組與Con組無(wú)明顯差異,見圖5。

        Fig.5 The changes of effects of different doses of H7 on the liver and kidney of mice(HE staining,×200)圖5 不同劑量H7對(duì)小鼠的肝臟及腎臟的病理形態(tài)學(xué)影響(HE染色,×200)

        2.5 H7藥代動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果 SD大鼠H7灌胃,HPLC測(cè)得5、10、15、30、60、120、240、360、480 min血藥濃度,按DAS 2.1.1程序經(jīng)計(jì)算機(jī)擬合,得出H7在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),測(cè)出AUC為(557.31±36.12)mg/(L·h);Cmax為(36.92±1.29)mg/L;tmax為2 h;t1/2為(22.13±1.74)h,見圖6。

        2.6 H7藥物組織分布 5 mg/kg的H7灌胃30 min后,由檢測(cè)結(jié)果可見H7在小腸中的濃度約是腦組織中的5 000倍,見圖7。

        Fig.6 Results of pharmacokinetic analysis of H7圖6 H7藥代動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

        Fig.7 Tissue distribution of H7圖7 H7藥物組織分布結(jié)果

        3 討論

        Cur是一種從姜科、天南星科等植物的根莖中提取的化學(xué)成分,具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)特性。Cur發(fā)揮抗癌作用主要是通過(guò)激活癌細(xì)胞凋亡途徑和抑制癌前過(guò)程,包括炎癥、血管生成和轉(zhuǎn)移[10]。但是,對(duì)Cur藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度的研究顯示,其穩(wěn)定性較差、水溶性低、生物利用度有限,在一定程度上阻礙了Cur作為臨床治療劑的應(yīng)用[11]。筆者團(tuán)隊(duì)前期設(shè)計(jì)合成并篩選出抑制17β-HSD3活性效果較好的Cur類似物H7,并發(fā)現(xiàn)H7抑制雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖的效果比Cur更顯著,提示H7作為17β-HSD3抑制劑可能具有治療前列腺癌的作用[7]。且有其他研究也證實(shí)Cur類似物可抑制17β-HSD3活性[12]。H7對(duì)17β-HSD3的抑制作用可能是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合了17β-HSD3的有效結(jié)構(gòu)域,這些需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

        在眾多參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的基因中,Caspase-3作為凋亡的執(zhí)行者,在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。研究表明,Cur可通過(guò)對(duì)Caspase激活途徑的調(diào)節(jié)來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡[13]。此外,上調(diào)凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)水平能夠治療前列腺癌[14]。本研究發(fā)現(xiàn),Cur、AR抑制劑和H7均不同程度上調(diào)了LNCaP細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。

        目前,被診斷出的前列腺癌有大部分是雄激素依賴性前列腺癌。雄激素與AR信號(hào)通路在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[15]。雄激素的主要成分是睪酮,筆者團(tuán)隊(duì)前期已通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H7能明顯降低LNCaP細(xì)胞中睪酮含量[7]。睪丸中雄激素的生物合成過(guò)程是以膽固醇為原料進(jìn)入線粒體,經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶(CYP11A1)催化后進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng),被3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)等催化生成脫氫表雄酮(DHEA)和雄烯二酮(Androstenedione),最后經(jīng)17β-HSD3催化生成睪酮,釋放到循環(huán)中。雄激素靶器官通過(guò)利用循環(huán)中的睪酮在5α-還原酶催化下轉(zhuǎn)化成二氫睪酮(DHT),與AR結(jié)合形成復(fù)合物,然后與特定的雄激素反應(yīng)元件(AREs)結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)。在AR信號(hào)通路中,17β-HSD3作用于該通路的下游。有前列腺癌活檢報(bào)告顯示,腫瘤組織中17β-HSD3 mRNA的表達(dá)水平是正常前列腺組織的30倍[16]。抑制17β-HSD3能影響睪酮的合成,從而影響雄激素依賴性靶組織的發(fā)育。因此,17β-HSD3可作為治療前列腺癌有潛力的靶標(biāo),其小分子抑制劑的開發(fā)已成為新熱點(diǎn)。本研究表明,Cur、AR抑制劑和H7均能下調(diào)LNCaP細(xì)胞中AR蛋白的表達(dá)水平,且H7組細(xì)胞中AR蛋白的表達(dá)水平下調(diào)最明顯,提示H7可能是通過(guò)抑制17β-HSD3導(dǎo)致AR蛋白表達(dá)水平降低,從而起到抑制AR信號(hào)通路、誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡的作用。

        急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,未發(fā)現(xiàn)H7有明顯的不良反應(yīng)。與前期實(shí)驗(yàn)Cur測(cè)得的AUC比較,本實(shí)驗(yàn)H7的藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)得到的AUC是Cur的10倍左右[9],半衰期亦延長(zhǎng);而且通過(guò)觀察H7的組織分布發(fā)現(xiàn),H7以胃腸吸收為主,基本不通過(guò)血腦屏障。本結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用H7提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

        綜上所述,Cur類似物H7可抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖,并通過(guò)上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能是通過(guò)抑制AR信號(hào)通路中的關(guān)鍵酶17β-HSD3活性來(lái)發(fā)揮作用。同時(shí),本研究發(fā)現(xiàn)H7沒有明顯的急性毒性作用,具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及進(jìn)一步研究的價(jià)值。

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