韓楊，包?；?，柏合，劉潔婷，孫文慧，袁曉環(huán)△

前列腺癌是發(fā)生在前列腺的實(shí)體惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球新增前列腺癌患者127.6萬(wàn)例，死亡35.9萬(wàn)例；在男性癌癥中，其發(fā)病和死亡占比分別為13.5%和6.7%，僅次于肺癌［1］。17β-羥基類固醇脫氫酶3（17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 3，17β-HSD3）是雄激素受體（androgen receptor，AR）信號(hào)通路下游的關(guān)鍵酶，在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究表明，17β-HSD3表達(dá)顯著上調(diào)能夠引起機(jī)體內(nèi)AR信號(hào)通路出現(xiàn)異常，誘導(dǎo)雄激素分泌增多，從而影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展［2］。姜黃素（Cur）是傳統(tǒng)中藥姜黃的重要成分。大量臨床研究表明，Cur能夠治療多種癌癥，包括前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等［3-5］。由于Cur中存在雙酮結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其穩(wěn)定性較差、生物利用度及腸道吸收率偏低，限制了進(jìn)一步的臨床應(yīng)用［6］。本課題組前期以Cur結(jié)構(gòu)為母體設(shè)計(jì)合成了生物利用度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的一系列Cur類似物H1~H9，并篩選出17β-HSD3選擇性抑制劑H7［7］。本研究旨在觀察H7的抗前列腺癌活性，探討其誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制，考察H7的急性毒性情況，并分析其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為開發(fā)抗前列腺癌的靶點(diǎn)藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 人雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；SPF級(jí)C57小鼠32只、SD大鼠20只，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物股份有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（遼）2015-001）。將小鼠和大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度（22±2）℃，濕度60%±5%，12 h交替照明，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 Cur（純度為99%）購(gòu)自Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；AR抑制劑ARN-509（純度為98%）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；Cur類似物H7（純度99.2%）由牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心設(shè)計(jì)合成［8］；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAN公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；蛋白酶及磷酸酶抑制劑購(gòu)自哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司；RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人β-actin購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3單克隆抗體、鼠抗人AR單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；FITC偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色液購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。371 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；IX70生物顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；xCELLience RTCA DP細(xì)胞分析儀器購(gòu)自美國(guó)ACEA公司；NanoDrop 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀購(gòu)自美國(guó)GE公司；Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；Agilent 1100高效液相色譜儀（HPLC）購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將LNCaP細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化后傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)筆者前期對(duì)各藥物濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)［7］，將細(xì)胞分為4組，分別為空白對(duì)照組（Con組，不加任何藥物）、Cur組（Cur 150μmol/L）、AR抑制劑組（AR inhibitor組，AR抑制劑5μmol/L）和Cur類似物H7組（H7組，H7 150μmol/L）。

1.2.2 xCELLience RTCA DP細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LNCaP細(xì)胞配制細(xì)胞懸液，在E-Plate 16孔板中加入50μL培養(yǎng)基測(cè)量基線，細(xì)胞懸液按照1×105個(gè)/孔接種于E-Plate 16孔板中，每孔100μL，于超凈工作臺(tái)靜置30 min后上機(jī)檢測(cè)，每15 min測(cè)定1個(gè)點(diǎn)，培養(yǎng)24 h，按照1.2.1實(shí)驗(yàn)分組分別在孔中加入不同藥物處理細(xì)胞，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，保持實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，當(dāng)活細(xì)胞與電子板中的電極相互作用時(shí)，自動(dòng)計(jì)算細(xì)胞指數(shù)（CI值）。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LNCaP細(xì)胞，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中12 h，按照1.2.1實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加藥，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用蛋白胰酶消化后收集細(xì)胞，離心后棄掉上清液，加入1 mL預(yù)冷PBS溶液重懸后再離心，此操作重復(fù)2次，吸棄上清液，加入1×結(jié)合緩沖液重懸后吸出100μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至4 mL培養(yǎng)管中，管中分別加入5μL PI染液和5μL FITC Annexin-V染液，室溫避光孵育15 min后加入400μL的1×結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀設(shè)置參數(shù)，1 h內(nèi)檢測(cè)樣品并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測(cè)Caspase-3、AR蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LNCaP細(xì)胞接種于6孔板中，待12 h細(xì)胞貼壁后按照1.2.1實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，充分震蕩后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，4℃，14 000×g離心10 min，收集上清液，采用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液，混勻后放入100℃水中使蛋白變性，10 min后冰上冷卻備用，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，取出PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫?fù)u床封閉1 h，TBST緩沖液洗去膜上封閉液，分別加入兔抗人Caspase-3單克隆抗體（1∶1 000）、鼠抗人AR單克隆抗體（1∶200）及β-actin抗體（1∶1 000），4℃過(guò)夜，回收一抗，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，分別加入山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）、山羊抗鼠IgG二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，將顯影液滴到PVDF膜上，置于成像儀顯影，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5 H7的急性毒性實(shí)驗(yàn) 取32只C57小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，分別為空白對(duì)照組（Con組，1%CMC-Na）、Cur類似物H7高劑量組（H7，100 mg/kg）、中劑量組（H7，50 mg/kg）、低劑量組（H7，25 mg/kg），H7用1%CMC-Na溶解。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃14 d，觀察小鼠一般行為活動(dòng)、體質(zhì)量和死亡情況。14 d后用10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，取材，取肝臟和腎臟石蠟包埋做HE染色。

1.2.6 HE染色觀察肝臟和腎臟組織病理學(xué)變化 取4%多聚甲醛溶液固定肝臟和腎臟組織，常規(guī)梯度脫水，石蠟包埋，使用切片機(jī)切片，切片厚度為4μm，采用HE染色法，中性樹膠封片，200倍生物顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟和腎臟組織的形態(tài)學(xué)變化情況。

1.2.7 藥代動(dòng)力學(xué)分析 取10只SD大鼠，用5 mg/kg的H7灌胃（1%CMC-Na溶解）。用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，分別在給藥后5、10、15、30、60、120、240、360、480 min眼眥取血，HPLC檢測(cè)血藥濃度，方法參考文獻(xiàn)［9］。按DAS 2.1.1程序經(jīng)計(jì)算機(jī)擬合，得到H7在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，測(cè)出血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC）、峰濃度（Cmax）、最高峰時(shí)間（tmax）和消除半衰期（t1/2）。

1.2.8 檢測(cè)H7藥物組織分布 取SD雄性大鼠10只，用5 mg/kg的H7灌胃（1%CMC-Na溶解），在給藥30 min后，用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，大鼠窒息斷頸取材，收集腦、肝、脾、肺、小腸、胃、腎、心和睪丸。HPLC檢測(cè)藥物在各器官中濃度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞活性的影響 細(xì)胞鋪板24 h，各組間LNCaP細(xì)胞的CI值未出現(xiàn)顯著差異。加藥后繼續(xù)觀察48 h（共72 h），與Con組比較，Cur組、AR inhibitor組和H7組處理的LNCaP細(xì)胞的CI值均明顯下降；與Cur組和AR inhibitor組比較，H7組LNCaP細(xì)胞的CI值下降更明顯，在給藥后36 h（60 h）差值最為明顯，給藥后48 h時(shí)各組差值逐漸平穩(wěn)。見圖1。

Fig.1 Real-time monitoring of changes in LNCaP cell activity圖1 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LNCaP細(xì)胞活性的變化

2.2 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡率的影響 Con組、Cur組、AR inhibitor組和H7組凋亡率（%）分別為10.97±0.14、15.80±0.26、21.43±0.72和27.93±1.92（n=3，F(xiàn)=49.690）。Con組、Cur組、AR inhibitor組和H7組LNCaP細(xì)胞凋亡率依次升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞的Caspase-3、AR蛋白表達(dá)水平的影響 與Con組比較，Cur組、AR inhibitor組和H7組LNCaP細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高，AR蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。見表1，圖3、4。

Fig.2 The effects of different drugs on LNCaP cell apoptosis rates圖2 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡率的影響

Tab.1 Comparison of Caspase-3 and AR protein expression levels between the four groups of LNCaP cells表1 各組LNCaP細(xì)胞Caspase-3、AR蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，x±s）

Fig.3 Effects of different drugs on the expression levels of Caspase-3 protein in LNCaP cells圖3 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

Fig.4 Effects of different drugs on the expression levels of AR protein in LNCaP cells圖4 不同藥物對(duì)LNCaP細(xì)胞AR蛋白表達(dá)水平影響

2.4 H7的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 高、中、低劑量組及Con組小鼠連續(xù)灌胃14 d，未發(fā)現(xiàn)活動(dòng)增加、流涎、抽搐、昏迷、勃起、腹瀉、肌張力改變、嗜睡、過(guò)度興奮、扭體（腹部收縮）和死亡等情況。14 d后，HE染色肝臟和腎臟，高、中、低劑量組與Con組無(wú)明顯差異，見圖5。

Fig.5 The changes of effects of different doses of H7 on the liver and kidney of mice(HE staining,×200)圖5 不同劑量H7對(duì)小鼠的肝臟及腎臟的病理形態(tài)學(xué)影響（HE染色，×200）

2.5 H7藥代動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果 SD大鼠H7灌胃，HPLC測(cè)得5、10、15、30、60、120、240、360、480 min血藥濃度，按DAS 2.1.1程序經(jīng)計(jì)算機(jī)擬合，得出H7在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，測(cè)出AUC為（557.31±36.12）mg/（L·h）；Cmax為（36.92±1.29）mg/L；tmax為2 h；t1/2為（22.13±1.74）h，見圖6。

2.6 H7藥物組織分布 5 mg/kg的H7灌胃30 min后，由檢測(cè)結(jié)果可見H7在小腸中的濃度約是腦組織中的5 000倍，見圖7。

Fig.6 Results of pharmacokinetic analysis of H7圖6 H7藥代動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

Fig.7 Tissue distribution of H7圖7 H7藥物組織分布結(jié)果

3 討論

Cur是一種從姜科、天南星科等植物的根莖中提取的化學(xué)成分，具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)特性。Cur發(fā)揮抗癌作用主要是通過(guò)激活癌細(xì)胞凋亡途徑和抑制癌前過(guò)程，包括炎癥、血管生成和轉(zhuǎn)移［10］。但是，對(duì)Cur藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度的研究顯示，其穩(wěn)定性較差、水溶性低、生物利用度有限，在一定程度上阻礙了Cur作為臨床治療劑的應(yīng)用［11］。筆者團(tuán)隊(duì)前期設(shè)計(jì)合成并篩選出抑制17β-HSD3活性效果較好的Cur類似物H7，并發(fā)現(xiàn)H7抑制雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖的效果比Cur更顯著，提示H7作為17β-HSD3抑制劑可能具有治療前列腺癌的作用［7］。且有其他研究也證實(shí)Cur類似物可抑制17β-HSD3活性［12］。H7對(duì)17β-HSD3的抑制作用可能是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合了17β-HSD3的有效結(jié)構(gòu)域，這些需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

在眾多參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的基因中，Caspase-3作為凋亡的執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。研究表明，Cur可通過(guò)對(duì)Caspase激活途徑的調(diào)節(jié)來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡［13］。此外，上調(diào)凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)水平能夠治療前列腺癌［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cur、AR抑制劑和H7均不同程度上調(diào)了LNCaP細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。

目前，被診斷出的前列腺癌有大部分是雄激素依賴性前列腺癌。雄激素與AR信號(hào)通路在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［15］。雄激素的主要成分是睪酮，筆者團(tuán)隊(duì)前期已通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H7能明顯降低LNCaP細(xì)胞中睪酮含量［7］。睪丸中雄激素的生物合成過(guò)程是以膽固醇為原料進(jìn)入線粒體，經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶（CYP11A1）催化后進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，被3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）等催化生成脫氫表雄酮（DHEA）和雄烯二酮（Androstenedione），最后經(jīng)17β-HSD3催化生成睪酮，釋放到循環(huán)中。雄激素靶器官通過(guò)利用循環(huán)中的睪酮在5α-還原酶催化下轉(zhuǎn)化成二氫睪酮（DHT），與AR結(jié)合形成復(fù)合物，然后與特定的雄激素反應(yīng)元件（AREs）結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)。在AR信號(hào)通路中，17β-HSD3作用于該通路的下游。有前列腺癌活檢報(bào)告顯示，腫瘤組織中17β-HSD3 mRNA的表達(dá)水平是正常前列腺組織的30倍［16］。抑制17β-HSD3能影響睪酮的合成，從而影響雄激素依賴性靶組織的發(fā)育。因此，17β-HSD3可作為治療前列腺癌有潛力的靶標(biāo)，其小分子抑制劑的開發(fā)已成為新熱點(diǎn)。本研究表明，Cur、AR抑制劑和H7均能下調(diào)LNCaP細(xì)胞中AR蛋白的表達(dá)水平，且H7組細(xì)胞中AR蛋白的表達(dá)水平下調(diào)最明顯，提示H7可能是通過(guò)抑制17β-HSD3導(dǎo)致AR蛋白表達(dá)水平降低，從而起到抑制AR信號(hào)通路、誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡的作用。

急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)H7有明顯的不良反應(yīng)。與前期實(shí)驗(yàn)Cur測(cè)得的AUC比較，本實(shí)驗(yàn)H7的藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)得到的AUC是Cur的10倍左右［9］，半衰期亦延長(zhǎng)；而且通過(guò)觀察H7的組織分布發(fā)現(xiàn)，H7以胃腸吸收為主，基本不通過(guò)血腦屏障。本結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用H7提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，Cur類似物H7可抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞增殖，并通過(guò)上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制AR信號(hào)通路中的關(guān)鍵酶17β-HSD3活性來(lái)發(fā)揮作用。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)H7沒有明顯的急性毒性作用，具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及進(jìn)一步研究的價(jià)值。