劉建民，張新華

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071)

良性前列腺增生癥(benign prostatic hyperplasia，BPH)是一種緩慢進展的中老年男性常見疾病[1]。雖然藥物及外科手術(shù)治療能夠延緩BPH的臨床進展，但尚無分子標(biāo)志物能夠準(zhǔn)確預(yù)測BPH的臨床進展。此前，我們通過二代基因測序，發(fā)現(xiàn)了一些BPH中表達上調(diào)的基因[2]。其中包括白介素21受體(interleukin-21 receptor，IL-21R)、多效生長因子(pleiotrophin，PTN)、基質(zhì)重塑相關(guān)5(matrix remodeling associated 5，MXRA5)和胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)。同時，我們發(fā)現(xiàn)：IL-21R通過促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而促進BPH的發(fā)展[3]；MXRA5通過激活絲裂原活化蛋白激酶通路，促進前列腺的增殖[2]；IGF-1也參與維持BPH增殖與凋亡的平衡[4]。報道發(fā)現(xiàn)，雄激素能夠調(diào)節(jié)前列腺組織內(nèi)PTN的轉(zhuǎn)錄和分泌[5]。這提示PTN可能作為雄激素的下游靶分子間接參與BPH的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及臨床資料收集收集來自武漢大學(xué)肝膽移植中心腦死亡并接受器官捐贈的5例年輕患者的正常前列腺組織，年齡為(28.2±4.4)歲。收集2018年9月至2019年9月在我院泌尿外科接受經(jīng)尿道前列腺電切除術(shù)(transurethral resection of the prostate，TURP)的BPH前列腺組織標(biāo)本104例。所有TURP切除組織的標(biāo)本切片由我院病理科醫(yī)師經(jīng)病理學(xué)診斷為BPH。同時收集對應(yīng)患者的基本信息及相關(guān)臨床檢查信息，包括年齡、體質(zhì)指數(shù)、前列腺體積、總前列腺特異性抗原(total prostate specific antigen，tPSA)、游離PSA(free PSA，fPSA)、最大尿流率、殘余尿、國際前列腺癥狀評分(International Prostate symptom Score，IPSS)及夜尿次數(shù)。所有人體標(biāo)本的收集和處理均按照我院倫理委員會批準(zhǔn)的指南進行。

1.2 組織芯片制備將所有組織標(biāo)本固定于10%中性甲醛緩沖液中，并以石蠟包埋后切片進行蘇木精-依紅(HE)染色。經(jīng)高年資病理科醫(yī)師對HE染色切片的代表區(qū)域進行評估，并標(biāo)記組織芯片靶點。使用組織芯片制作儀(mitogen公司)制作組織芯片，取樣直徑1.5 mm，以16×10點組織列陣，共104個點。制備完成的組織芯片以4 μm厚度連續(xù)切片。

1.3 免疫組織化學(xué)染色先將組織石蠟切片脫蠟，然后在檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中進行抗原恢復(fù)。在0.3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2中封閉后，以1∶100稀釋比孵育一抗IL-21R(abcam公司)、PTN(abcam公司)、MXRA5(abcam公司)及IGF-1(abclonal公司)，然后以二抗孵育。用過氧化物酶和3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽顯色，并在Olympus-dp72光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)下觀察，選取鏡下5個視野并拍照，使用Image J分析并計算陽性表達面積比。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料104例BPH患者的基本情況見表1。

表1 104例BPH組織芯片臨床信息及相關(guān)蛋白表達量

2.2 組織學(xué)表達定位圖1顯示：IL-21R和PTN均在增生前列腺組織上皮部分表達豐富，而在前列腺間質(zhì)部分幾乎沒有表達；MXRA5主要表達在增生前列腺間質(zhì)部分，而在前列腺上皮部分僅有微弱的表達；強染色的IGF-1棕色顆粒滿布于整個視野中，提示IGF-1無論在上皮成分還是間質(zhì)成分，都有非常豐富的表達。同時，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，與正常前列腺組織相比，IL-21R、PTN、MXRA5及IGF-1在增生前列腺組織中的表達顯著增加。

IL-21R：白介素-21受體；PTN：多效生長因子；MXRA5：基因重塑相關(guān)5；IGF-1：胰島素樣生長因子。

2.3 四個蛋白的表達量與BPH臨床進展因素的Pearson相關(guān)分析見表2。IL-21R蛋白的表達水平與BPH患者的前列腺體積、最大尿流率及夜尿次數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、PSA及IPSS評分均無顯著相關(guān)性；PTN蛋白水平僅與BPH患者的游離PSA水平正相關(guān)(P<0.05)；MXRA5蛋白水平與BPH患者的前列腺體積(P<0.05)及IPSS評分(P<0.01)正相關(guān)；IGF-1蛋白水平與BPH患者的前列腺體積(P<0.01)及殘余尿量正相關(guān)(P<0.05)。

表2 不同蛋白表達量與前列腺增生臨床進展危險因素的相關(guān)性(r值)

3 討 論

本研究通過收集BPH組織標(biāo)本制作組織芯片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法計算上述4個差異基因的表達水平，分析其與BPH臨床進展危險因素的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-21R、PTN、MXRA5及IGF-1在BPH組織中的表達顯著增加。此外，IL-21R主要表達于前列腺上皮，與BPH患者的前列腺體積、最大尿流率及夜尿次數(shù)呈正相關(guān)；PTN主要表達于前列腺上皮，僅與BPH患者的游離PSA水平正相關(guān)；MXRA5主要定位于前列腺間質(zhì)中，與BPH患者的前列腺體積及IPSS評分正相關(guān)；IGF-1分布于前列腺上皮及間質(zhì)中，與BPH患者的前列腺體積及殘余尿量正相關(guān)。

在臨床上，BPH患者多伴有前列腺炎。有研究表明，伴有前列腺炎發(fā)生的BPH患者具有更大的前列腺體積、更快的臨床進展以及更高的手術(shù)治療率[3]。此前，我們使用前列腺細(xì)胞與單核細(xì)胞THP-1共培養(yǎng)系統(tǒng)及BPH伴前列腺炎的大鼠模型，闡明了IL-21R在前列腺增生組織中高表達，并可以通過調(diào)控前列腺增殖與凋亡的平衡及EMT來促進BPH的發(fā)生發(fā)展[3]。本研究從人前列腺組織標(biāo)本出發(fā)，是對前期實驗的補充及延伸，進一步證實了IL-21R與BPH臨床進展的危險因素相關(guān)。

雄激素是BPH發(fā)生發(fā)展的必要條件，而不是充分條件。證據(jù)表明，細(xì)胞生長因子與類固醇激素之間的相互作用可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的失衡從而誘導(dǎo)BPH的發(fā)生。因此，生長因子可能是雄激素最初的作用靶點。在BPH中表達上調(diào)的PTN及IGF-1都屬于生長因子。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達IGF-1的轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)明顯的前列腺增大[6]，我們的前期實驗證實IGF-1的確可以影響體外培養(yǎng)的前列腺細(xì)胞的增殖水平。一項對中國人的研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)循環(huán)的IGF-1和IGFBP-3的水平與BPH明顯相關(guān)[7]，而2003年在對美國明尼蘇達州奧姆斯特縣(Olmsted County)的一項群體研究中并沒有發(fā)現(xiàn)IGF-1與前列腺體積的相關(guān)性。這種結(jié)果差異，可能是因為被檢測人群的不同以及檢測方法的不同。

我們最近發(fā)現(xiàn)，MXRA5在BPH中發(fā)揮重要的作用[2]。由于MXRA5在前列腺間質(zhì)中有著豐富的表達，我們在體外培養(yǎng)的前列腺間質(zhì)細(xì)胞WPMY-1中轉(zhuǎn)染小干擾RNA，發(fā)現(xiàn)下調(diào)MXRA5基因后可以延緩細(xì)胞的生長并引起細(xì)胞周期阻滯，該過程與MAPK通路的激活有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)MXRA5蛋白的表達水平與前列腺體積及IPSS評分顯著相關(guān)，提示MXRA5有可能成為預(yù)測BPH臨床進展的分子標(biāo)志物。

綜上所述，基于此前我們對IL-21R等4個指標(biāo)在BPH發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究，我們發(fā)現(xiàn)IL-21R、PTN、MXRA5及IGF-1在一定程度上與BPH的臨床進展危險因素顯著相關(guān)，提示這4個基因有望單獨或結(jié)合起來成為預(yù)測BPH臨床進展的分子標(biāo)志物。