李 淳， 劉學輝， 卜昶棟， 姚勝軍， 王莉爽*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州醫(yī)科大學 生物與工程學院， 貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】番茄在貴州常年種植，而番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)引起的番茄黃化曲葉病(Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD)是危害番茄生產(chǎn)的主要病害之一，嚴重影響番茄的優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)。因此，明確貴州番茄TYLCV的株系變異與分化對了解該病害的發(fā)生、傳播以及防治措施的制定具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】番茄黃化曲葉病毒是雙生植物真菌病毒目(Geplafuvirales)雙生病毒科(Geminiviridea)菜豆金色黃花葉病毒屬(Begomovirus)成員[1]。TYLCV為單鏈環(huán)狀DNA(single stranded DNA，ssDNA)，具有孿生顆粒形態(tài)，基因組由大小為2 500～2 800 bp的DNA-A和DNA-B組成。目前國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的番茄黃化曲葉病毒大多為DNA-A，基因組大小為2 700～2 800 bp[2]。TYLCV主要通過帶毒的煙粉虱進行傳播，并可通過嫁接和種苗調(diào)運傳播，并不通過種子和機械摩擦接種傳播[3]。我國于2006年在上海首次發(fā)現(xiàn)TYLCV[4]，之后在20余省先后報道該病毒的發(fā)生[5]。國際病毒委員會根據(jù)地區(qū)和序列的不同將TYLCV分為Tomato yellow leaf curl virus-Israel(TYLCV-IL)、Tomato yellow leaf curl virus-Iran(TYLCV-IR)、Tomato yellow leaf curl virus-Mild(TYLCV-MLD)、Tomato yellow leaf curl virus-Oman(TYLCV-OM)、Tomato yellow leaf curl virus-Gezira(TVLCV-Gez)[6]等株系。TYLCV侵染番茄的典型癥狀為上部新葉葉片黃化變小，葉緣卷曲[7]?！狙芯壳腥朦c】目前貴州針對番茄病毒的研究主要集中在RNA病毒上，針對番茄DNA病毒的研究尚屬空白?！緮M解決的關鍵問題】對貴州省關嶺縣采集的番茄疑似TYLCV樣品進行分子鑒定，擴增并克隆出TYLCV貴州分離物DNA-A全長序列，分析貴州番茄TYLCV分離物與其他地區(qū)的系統(tǒng)進化關系，以期為貴州番茄黃化曲葉病毒病的科學防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病樣品采集 疑似番茄病毒病樣品于2019年秋季采自貴州省關嶺縣，保存在-80℃冰箱。以TYLCV侵染發(fā)病的番茄植株葉片作為陽性對照，以未發(fā)病的健康番茄植株葉片作為陰性對照。

1.1.2 試劑 TransStart?FastPfu DNA Polymerase、pEASY?-Blunt Simple Cloning Kit、EasyPure?Quick Gel Extraction Kit及Trans2K?Plus DNA Marker，購自北京全式金生物有限公司；其他生化試劑及普通化學試劑，均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 番茄葉片樣本總DNA提取采用CTAB法[3]。

1.2.2 PCR擴增與測序 采用劉勇等[8]報道的雙生病毒通用引物BegoAFor1 (5′-TGYGARGGICCITGYAARGTYCARTC-3′)和BegoARev1(5′-ATHCCMDCH ATCKTBCTITGCAATCC-3′)進行番茄疑似病毒病樣品擴增，PCR反應體系：Template 2 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μM) 1 μL，Reverse Primer(10 μM) 1 μL，TransStart?FastPfu DNA Polymerase 1 μL，5×TransStart?FastPfu Buffer 10 μL，無核酸酶水35 μL，總體積50 μL。反應程序：95℃ 3 min；95℃ 15 s，50℃ 15 s，72℃ 1 min 12 s，35個循環(huán)72℃ 5 min。

采用劉文浩等[9]報道的DNA-A全長引物TY3(5′-CAHTGGCTCGCAGAGGGT-3′)和TY5(5′-TTCGCAAGTATCAATCAAGGT-3′)擴增DNA-A全長。PCR反應程序：95℃ 3 min；95℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 3 min，35個循環(huán)；72℃ 5 min。以番茄黃化曲葉病毒源樣品的DNA為陽性對照，以健康植株為對照。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后克隆至pEASY?-Blunt Simple Cloning Kit載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，經(jīng)過菌落PCR鑒定后，選取3個陽性克隆進行測序，引物合成及測序由重慶擎科興業(yè)生物科技有限公司完成。

采用NCBI的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對測序的序列進行比對，確認其種類，并用Danman 6.0進行全基因組序列分析，然后利用MEGA7.0選擇近鄰算法NJ(Neighbor-Joining)對該分離物序列和GenBank中不同地區(qū)的TYLCV病毒分離物序列(表1)進行序列同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析，重復次數(shù)是1 000。

表1 不同地區(qū)TYLCV分離物及其在國際基因庫的收錄信息

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄疑似 TYLCV樣品檢測

用雙生病毒通用引物BegoAFor1/BegoARev進行PCR擴增，以提取的感病番茄總DNA為模板，得到1 200 bp大小條帶(圖1)。產(chǎn)物回收后連接到T載體，經(jīng)克隆測序后在NCBI上進行Blast比對，與TYLCV序列相似性達99%，確認其為TYLCV序列。

注：M為2k plus marker，1為陰性對照，2為陽性對照，3～12為樣品。

2.2 TYLCV-GZ全長基因組擴增與克隆

用TYLCV DNA-A全長引物TY3/TY5擴增感染TYLCV的番茄樣品的DNA，獲得2 781 bp大小的特異性條帶，且目的條帶單一，擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、克隆后測序，將TYLCV-GZ的DNA-A全長序列提交到GenBank，登錄號為MW286511。

圖2 TYLCV-GZ全長基因組擴增

2.3 TYLCV貴州分離物全長序列的比較

從表2可知，TYLCV-GZ的DNA-A與國內(nèi)外不同株系的TYLCV的相似性為89.8%～99.2%，與TYLCV-Mexico和TYLCV-XJKS的相似性最高，核苷酸一致性達99%以上，而與TYLCV-OM相似性最低，只有89.8%。從圖3看出，以TYLCCNV、TYLCThV和TYLCGdV為外組，TYLCV-GZ與國內(nèi)其他地區(qū)TYLCV分離物歸屬一致，屬于TYLCV-IL株系。其中，TYLCV-GZ、TYLCV-XJKS和TYLCV-SDLC聚在1個小分支上，說明，TYLCV貴州分離物與新疆、山東分離物的親緣關系最近。

表2 番茄黃化曲葉病貴州分離物和已報道的 TYLCV分離物基因組序列相似性

圖3 基于TYLCV相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 討論

目前，國內(nèi)外對TYLCV的研究較多，但由于TYLCV普遍存在基因重組，該病毒在煙草、番茄和辣椒等寄主上存在外，中國在黃瓜和藿香上均有新發(fā)現(xiàn)[10-11]。TYLCV變異頻率較高，STEFANO等[12]從攜帶Ty-1抗性基因的番茄植株中分離到1個在西西里島常見的重組番茄黃卷葉病毒株系的核苷酸序列。TYLCV復合侵染現(xiàn)象明顯，復合種類多變，如在土耳其番茄上發(fā)現(xiàn)番茄黃曲葉病毒和番茄褪綠病毒(Tomato chlorosis virus，ToCV)復合侵染[13]。在中國藿香上發(fā)現(xiàn)，病毒病是由TYLCV和CMV侵染所致[11]。鑒于TYLCV的發(fā)生變異及復合侵染種類等復雜多變，該病毒的防控變得十分困難。目前，TYLCV防控主要從傳播昆蟲煙粉虱和寄主抗性品種等方面開展，一是減緩煙粉虱的傳播速率，如乙?；视王?BemidetachTMEC)對溫室番茄植株上煙粉虱傳播的TYLCV有抑制作用[14]。二是培育番茄抗性品種?；蚪M編輯技術特別是CRISPR-Cas9技術的研究成果，為培育抗病作物提供了一種可行的解決方案。病毒誘導的CRISPR-Cas9系統(tǒng)提高了對番茄黃曲葉病毒的抗性[15]。三是尋找抗性相關基因或病原菌抑制TYLCV的傳播，如番茄的SlPDI基因可以通過增強ER蛋白的折疊功能和促進抗氧化相關蛋白的合成和構(gòu)象來調(diào)節(jié)植物對TYLCV的抗性[16]。在溫室條件下接種番茄大芽植原體(TBBP、16SrII-D)與TYLCV后，植物原體和病毒濃度顯著降低，表明TYLCV和TBBP在侵染番茄植株時存在拮抗作用[17]。上述研究成果有望為TYLCV的防控提供新思路新策略，但是對TYLCV的檢測及其分離物的鑒定是開展防控的前提。

據(jù)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙粉虱在貴州番茄地普遍存在，但TYLCV對貴州番茄的危害未見報道。因此，該研究對貴州番茄的疑似TYLCV樣品進行PCR檢測和DNA-A全基因組序列的克隆和分析表明，經(jīng)PCR擴增出TYLCV的目的片段，且貴州TYLCV分離物的DNA-A全基因組序列與新疆分離物的核苷酸一致性達99.1%。這是TYLCV侵染貴州番茄的首次報道。

在雙生病毒科病毒同源性比較中，同源性大于89%被認為是同一病毒的不同株系，在此基礎上，基因組序列同源性大于94%，則被認為是同一株系的不同分離物[18]。該研究選取來自不同國家和地區(qū)的9個毒株樣品序列進行同源性分析發(fā)現(xiàn)，TYLCV-GZ序列與用來比對的其他株系相似度均在89%以上，與TYLCV-Mexico同源性最高，達99.2%，可以認為，該分離物屬于TYLCV。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，TYLCV-GZ序列與TYLCV-SDLC和TYLCV-XJKS親緣關系最近，同屬TYLCV-IL株系。根據(jù)周瑩等[19]的報道，TYLCV入侵我國內(nèi)陸有2條路線，分別為江蘇路線(由江蘇一帶入境，逐步傳入內(nèi)陸安徽、河南、河北、山東、北京、遼寧、新疆等地)和廣東路線(經(jīng)過上海、浙江，逐步傳入內(nèi)陸湖北、河南、山東、河北、山西、北京及天津等地)，從親緣關系看，TYLCV-GZ極有可能來自江蘇路線；但從地理位置看，貴州離山東和新疆都很遠，因此，病毒具體的傳播路線和傳播方式有待進一步研究。郝浩永等[20]研究發(fā)現(xiàn)，TYLCV與煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus，TbCSV)分離物TbCSV-India的進化關系在AC4氨基酸序列水平很接近，由此推測，自然界中TYLCV與TbCSV在AC4序列處可能已經(jīng)發(fā)生廣泛的重組，帶來更強的致病性。該研究僅對番茄樣品進行鑒定，并未研究遺傳重組現(xiàn)象，下一步需在多種作物上研究貴州雙生病毒是否有遺傳變異現(xiàn)象發(fā)生。

4 結(jié)論

將采自貴州省關嶺縣的番茄疑似TYLCV樣品提取DNA，經(jīng)菜豆金色黃花葉病毒屬(Begomovirus)通用引物BegoAFor1/BegoARev1進行PCR檢測，用TY3/TY5引物擴增并克隆其DNA-A全長序列，且對其全長序列進行同源性分析及系統(tǒng)進化情況發(fā)現(xiàn)，從病樣中分離得到的致使貴州番茄葉片表現(xiàn)黃化、皺縮等癥狀的病原為TYLCV，其DNA-A全長序列與TYLCV-Mexico和TYLCV-XJKS的相似性最高，核苷酸一致性達99%以上，且與國內(nèi)其他地區(qū)TYLCV分離物歸屬一致，屬于TYLCV-IL株系；其與TYLCV-SDLC(山東)和TYLCV-XJKS(新疆)聚在一個分支上，說明其親緣關系最近。引起貴州關嶺縣番茄葉片黃化、皺縮的病原為番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)。