韓春妮， 王軍利， 豆秀英， 張阿寧， 李美索， 仝玉琴， 馮馨樂

(1.咸陽職業(yè)技術(shù)學院，陜西 咸陽 712046； 2.永壽縣農(nóng)技推廣中心， 陜西 永壽 713400； 3.淳化縣農(nóng)技推廣中心， 陜西 淳化 711200； 4.禮泉縣植保植檢站， 陜西 禮泉 713200)

0 引言

【研究意義】草莓為薔薇科草莓屬草本水果。全球有草莓屬植物50余種，在全球廣為栽培的草莓栽培種是通過八倍體鳳梨草莓(Fragariaananassa)培育而成，而其他倍性的草莓屬植物，多以野生或半野生狀態(tài)分布于世界各地[1-3]。全球常見的野生草莓約有20種，中國自然分布11種左右[1-5]。可見，中國的草莓種質(zhì)資源十分豐富，基因庫較大。由于歷史原因，中國草莓育種工作一直比較落后，中國廣為栽培的草莓種基本引種自歐美或日本，自有知識產(chǎn)權(quán)的栽培種較少[3-6]。因此，培育自有知識產(chǎn)權(quán)的草莓栽培種對促進我國草莓種植業(yè)的發(fā)展具有重要現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，為培育中國自有知識產(chǎn)權(quán)的草莓栽培種，增強草莓栽培種的選擇性，同時，為把中國野生草莓特有的抗逆性強、香味濃郁、果色豐富等優(yōu)質(zhì)基因引入栽培種，我國科學家進行不懈努力并取得一定成效[7-10]?！狙芯壳腥朦c】廣泛分布于陜西省秦巴山區(qū)的東方草莓，為四倍體野生草莓[1]，其野生環(huán)境為海拔600～1 800 m的林間或溝坎荒坡、砂地、草叢，該野生種植株較矮，匍匐莖細長，具有較強的抗逆性，耐寒、耐旱能力非常強；其葉片呈卵形且較小，兩性花；果實為圓形或橢圓形，深紅色；種子陷于果面下；果肉細膩，果香濃郁[3-7]。目前，此珍貴的野生草莓種質(zhì)資源還未得到充分有效的利用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以野生東方草莓匍匐莖的莖尖為材料，研究東方草莓的莖尖組培快繁技術(shù)，為其離體染色體加倍等育種工作提供前期材料，促進野生草莓種質(zhì)資源的有效利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的東方草莓野生資源采集自陜西省太白山自然保護區(qū)。2018年5月中旬，東方草莓果實成熟期，于陜西省太白縣的太白山自然保護區(qū)挖回多株，栽培于咸陽職業(yè)技術(shù)學院園林園藝實訓基地，設立專門圃地，根據(jù)其匍匐莖、花、果實、葉片等器官的形態(tài)特征，運用雷家軍等[8]相關(guān)的鑒定資料和方法，以及《中國植物志》《中國果樹分類學》《秦嶺植物志》等資料[9-11]，對其進行檢索與鑒定，確定其為東方草莓。

1.2 試驗方法

1.2.1 活性炭對東方草莓褐化的影響及無菌苗的獲得 2019年5月下旬，于晴天午后選取健壯、無病蟲害的東方草莓苗，用手術(shù)剪剪取長度為1.0～2.0 cm的匍匐莖頂端多枚放于大燒杯中，流水沖洗12 h以上，在超凈工作臺上用無菌鑷子將其夾出，放入盛有75%酒精的燒杯中消毒20～25 s，再用2%的NaClO消毒15 ～20 min，無菌水沖洗3～5次，再用高溫、高壓滅菌后的濾紙吸干表面水分，放置在墊有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用高溫滅菌后晾涼的解剖刀切取長0.5～0.8 cm的莖尖(帶1個葉原基)作為外植體，接種在基本培養(yǎng)基為MS，并添加0.4 mg/L 6-BA、6 g/L瓊脂粉及30 g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基上，pH 5.8～6.0。

為研究活性炭對外植體褐化的影響，活性炭的添加量設置4個對比梯度，分別為0 g/L、0.5 g/L、 1.0 g/L、1.5 g/L。每個培養(yǎng)瓶接種5個外植體，每組試驗接種20瓶。接種后將培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，觀察外植體污染情況，1 d后及時將未發(fā)生污染的外植體轉(zhuǎn)接到相應的同類新培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件：光照時長為12～14 h/d，光強為1 800～2 200 lx，溫度為(22±2)℃。在外植體接種的消毒過程中，由于東方草莓通體被有較長絨毛，為使消毒徹底，消毒過程不斷搖動燒杯或用無菌玻璃棒不斷攪拌。接種4 d后，無菌苗開始褐化。21 d時，統(tǒng)計褐化情況，并計算褐化率。

1.2.2 不同濃度6-BA對東方草莓離體增殖的影響 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L，瓊脂粉6 g/L，pH5.8～6.0，NAA濃度為0.1 mg/L。6-BA設置6個濃度處理：0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.6 mg/L。選取由莖尖培養(yǎng)而得的生長均勻、高度4～5 cm、具有4～5片葉子的東方草莓無根試管苗，將其接種到相應培養(yǎng)基上。每個培養(yǎng)瓶接種5個無根試管苗，每個處理接種10瓶。接種30 d后，統(tǒng)計外植體增殖倍數(shù)。

1.2.3 基本培養(yǎng)基和生長素種類對東方草莓生根的影響 基本培養(yǎng)基設置MS培養(yǎng)基和1/2 MS培養(yǎng)基2個試驗，生長素類調(diào)節(jié)劑選擇IBA和NAA 2種，每種調(diào)節(jié)劑設置0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L共 4種濃度。無根草莓試管苗的選取：在MS+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)而得的生長健壯的無根草莓苗，高度5 cm左右，具有4～5片葉子。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種3株無根試管苗。接種21 d后，觀察根系生長情況，并統(tǒng)計生根數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)運用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析及結(jié)果差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基活性炭不同添加量東方草莓外植體的污染及褐化情況

由表1看出，培養(yǎng)基活性炭不同添加量各處理東方草莓外植體的污染率無顯著差異，說明污染率和培養(yǎng)基無關(guān)系。培養(yǎng)基中添加活性炭，對褐化的影響比較顯著。不添加活性炭的培養(yǎng)基，其外植體褐化率高達84.1%，褐化致死率達51.2%；培養(yǎng)基添加活性炭后，褐化率及褐化致死率均大幅下降。東方草莓的外植體接種時，培養(yǎng)基中添加活性炭有利于降低褐化率，此結(jié)果與葉睿華等[12-13]在其他植物的試驗結(jié)果相似。當活性炭添加量為1.0 g/L時，褐化率及褐化致死率相對較低。

表1 不同活性炭添加量東方草莓外植體的污染及褐化情況

未褐化或褐化程度不嚴重的莖尖，在接種21 d后，不經(jīng)愈傷組織階段而直接萌發(fā)新芽，最終形成叢生芽，從而獲得東方草莓無菌苗。

2.2 不同濃度6-BA培養(yǎng)東方草莓的離體增殖情況

由表2看出，當6-BA的濃度為0.1～0.2 mg/L時，東方草莓長勢健壯，但增殖倍數(shù)相對較低；當6-BA的濃度增加至0.3～0.4 mg/L時，增殖倍數(shù)隨濃度的增加而增加，增殖苗健壯，葉色濃綠；當6-BA的濃度增加至0.5 mg/L時，增殖倍數(shù)開始下降，且增殖苗開始有黃化現(xiàn)象出現(xiàn)。當6-BA濃度增加至0.6 mg/L時，增殖倍數(shù)急劇下降，且苗低矮、皺縮畸形，黃化程度嚴重。在基本培養(yǎng)基為MS且NAA濃度為0.1 mg/L時，東方草莓離體增殖的最佳6-BA添加濃度為0.4 mg/L，其增殖倍數(shù)為11.26倍。

表2 不同濃度6-BA培養(yǎng)東方草莓無菌苗的增殖效果

2.3 不同基本培養(yǎng)基與生長素種類培養(yǎng)東方草莓的生根情況

從表3看出，當生長調(diào)節(jié)物為IBA時，接種21 d時，1/2 MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基的東方草莓無根試管苗生根率均達100%，高于NAA對根生長的誘導率；當生長調(diào)節(jié)劑為NAA，誘導生成的根普遍粗且健壯，平均根長相對較大，且單株誘導生根數(shù)更多，植株在出瓶練苗時更易成活；基本培養(yǎng)基為1/2 MS且NAA濃度為0.3 mg/L的培養(yǎng)基其株平均根數(shù)最多，為5.13根/株，平均根長也最長，為1.01 cm。

表3 不同基本培養(yǎng)基與生長素種類培養(yǎng)東方草莓的生根效果

雖然添加生根調(diào)節(jié)劑IBA時生根率達100%，但添加NAA生根調(diào)節(jié)劑誘導的不定根更粗、更健壯、長度更長。另外，觀察發(fā)現(xiàn)，當誘導時間超過30 d時，添加NAA生根調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基其誘導生根率也達100%。故此認為，誘導東方草莓無根試管苗生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.3 mg/L NAA。

3 討論

野生草莓較現(xiàn)有栽培草莓具有較大優(yōu)勢，其抗病蟲害、抗逆性更強，可溶性有機物種類更多，果實顏色更豐富，果實香味物質(zhì)種類更多[1-8]。中國作為全球野生草莓的主要發(fā)源地之一，具有豐富的野生草莓資源，要利用好這些資源，就有必要對其進行詳細的調(diào)查、搜集、整理和研究。野生東方草莓的抗寒性和抗旱性均很強，生長健壯，葉色濃綠，果實顏色深紅，果肉綿軟，香味獨特，是一種優(yōu)質(zhì)的雜交育種資源，也可以通過染色體加倍、細胞融合或者轉(zhuǎn)基因等方法進行育種，以使該優(yōu)質(zhì)基因源得到充分利用[12-17]。對野生東方草莓進行組織培養(yǎng)研究，建立其莖尖培養(yǎng)快繁體系，為其后續(xù)通過染色體加倍、細胞融合或轉(zhuǎn)基因方法進行育種等工作奠定基礎，也為其快繁探索道路，對其野生資源的開發(fā)、利用具有一定的現(xiàn)實意義，同時也為其他草莓屬植物的組培快繁提供借鑒。

試驗發(fā)現(xiàn)，剝?nèi)〉那o尖外植體越小，其褐化率及褐化死亡率越高，相反，剝?nèi)〉那o尖外植體越大，褐化程度越低且越有利于外植體成活，該結(jié)論與王軍利等[3，15-16]的研究結(jié)論一致。由此可見，在草莓屬植物組織培養(yǎng)時，其外植體切取越小，越容易褐化。6-BA對東方草莓離體增殖影響的研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度增加，東方草莓離體增殖倍數(shù)增大，但達到某一峰值后，增殖倍數(shù)開始下降，與王軍利等[3，15]的研究結(jié)論基本一致。在基本培養(yǎng)基和生長素對東方草莓無根苗生根的影響試驗中發(fā)現(xiàn)，IBA作為添加的生長調(diào)節(jié)物，培養(yǎng)21 d時無根試管苗的生根率達100%；在添加IBA或NAA生長調(diào)節(jié)劑條件下，1/2MS培養(yǎng)基上無根試管苗生根時間都早于MS培養(yǎng)基，且生根量相對較大，長度較長，與王軍利等[3，15]的研究結(jié)論一致。試驗還發(fā)現(xiàn)，NAA作為生根調(diào)節(jié)劑，所生成的根普遍更粗、更健壯，該結(jié)論與王軍利等[3]在五葉草莓上的研究結(jié)論一致，而與王燕等[15]對黃毛草莓的研究不一致?？梢?，同為草莓屬植物，不同的種之間，試驗結(jié)果有差異。因此，在構(gòu)建不同植物的組織培養(yǎng)體系時，應針對具體植物而言，合適的培養(yǎng)基和添加劑應通過具體試驗來取得和驗證。

4 結(jié)論

通過離體莖尖培養(yǎng)，可建立野生東方草莓離體組培快繁體系，進而為其離體誘導及離體染色體加倍等育種工作提供前期材料和技術(shù)。野生東方草莓可利用其匍匐莖的莖尖在MS+0.4 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上獲得無菌苗，培養(yǎng)基中添1.0 g/L活性炭(AC)有利于預防外植體褐化；適合東方草莓快繁的培養(yǎng)基為MS+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其增殖倍數(shù)為11.26倍；適合其生根的培養(yǎng)基為1/2 MS+0.3 mg/L NAA，誘導根數(shù)多、根粗、根長，可獲壯苗。