練啟仙, 劉健鋒, 楊茂發(fā)*, 羅 亭, 周小蕓, 吳 廣

(1.貴州大學， 貴州 貴陽 550025； 2.興義民族師范學院， 貴州 興義 562400)

0 引言

【研究意義】大青葉蟬Cicadellaviridis分布范圍廣，國外主要在日本、東南亞、印度以及歐洲等國家發(fā)生危害，我國北自黑龍江，南至海南，東自江蘇、山東，西至西藏、新疆均有分布[1]。該害蟲可危害禾谷類農(nóng)作物、果蔬等160余種植物[1]。大青葉蟬主要是以成蟲和若蟲危害葉片，刺吸汁液，造成褪色、畸形、卷縮，甚至全葉枯死[2]，同時大青葉蟬還可傳播植物病原菌[2-4]，是危害果樹及林木的大敵。經(jīng)研究，昆蟲體內(nèi)具有內(nèi)共生菌，同時內(nèi)共生菌可用于害蟲防治以及降低昆蟲傳播病毒的能力[5]，因此探明大青葉蟬體內(nèi)共生菌的分布，對利用調(diào)控體內(nèi)共生菌以控制該害蟲、減少蟲傳植物病毒病、化學農(nóng)藥對環(huán)境的污染和天敵等有益生物的傷害具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】內(nèi)共生菌廣泛分布于昆蟲中，內(nèi)共生菌能影響宿主所需的氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[6-8]，使雄蟲雌性化[9-10]，影響宿主的生長與繁殖[11]。但共生菌在不同種類昆蟲體內(nèi)的分布部位存在差異。如油橄欖實蠅幼蟲中，共生菌存在于中腸胃盲囊中[12]；內(nèi)共生菌存在于菌胞體內(nèi)的昆蟲有藥材甲和煙草甲[13]；NODA等[14]在飛虱的脂肪體中發(fā)現(xiàn)了類酵母菌；沃爾巴克氏體(Wolbachia)主要分布于昆蟲生殖器官中[15]?！狙芯壳腥朦c】目前，已在大青葉蟬中檢測到了內(nèi)共生菌Sulciamuelleri[16-18]、Sodalissp.[17-18]和立克次氏體(Rickettsiasp.)[19]，但關(guān)于Sulciamuelleri、Sodalissp.在大青葉蟬中的分布及對其生長發(fā)育的影響尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過用特異引物和PCR技術(shù)研究大青葉蟬體內(nèi)共生菌的分布及其拷貝數(shù)，為利用內(nèi)共生菌對大青葉蟬進行生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 大青葉蟬發(fā)生期，于貴陽市花溪區(qū)雜草地隨機采集大青葉蟬成蟲(雌、雄)，在室內(nèi)利用水稻苗飼養(yǎng)產(chǎn)卵，卵孵化為若蟲，成長為成蟲，期間收集卵、1～5齡若蟲和雌雄成蟲供試驗用。

1.1.2 引物與探針 用Primer 5設計Sulciamuelleri和Sodalissp.的16S rDNA序列的特異引物和TaqMan探針，由上海生物生工公司合成。

引物序列：SulendCV-F，5′-GTAGCGGTGAAATGCGTAGAT-3′；SulendCV-R，5′-TTCAACCTTGCGGTCGTACT-3′；SodendCV-F，5′-AAAGGAGACTGCCGGTGATAA-3′；SodendCV-R，5′-GGACTACGACGCACTTTATGAGA-3′[20-21]。

探針序列：SulendCV-P，5′-CCAATAGCGAAAGCAAGTTACTAAGCCT-3′；SodendCV-P，5′-CATGATGACTTGACGTCATCCCTACCT-3′[20-21]。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及PCR擴增 將保存于-20℃的不同蟲態(tài)的大青葉蟬清洗干凈后放在1.5 mL的無菌離心管中磨碎，然后根據(jù)QIAGEN試劑盒說明書的步驟提取樣品DNA，并用特異引物進行PCR擴增。反應體系總體積為25 μL，其中包括含Mg2+的10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 18 μL。PCR的反應程序：預變性95℃ 3 min，變性94℃ 30 s，退火57℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，循環(huán)35個，最后延伸72℃ 10 min。完成擴增后進行凝膠電泳檢測。

1.2.2 標準質(zhì)粒的提取與測序 PCR純化產(chǎn)物與pMD?18-T載體相連接后將其轉(zhuǎn)到感受態(tài)細胞中(Trans1-T2)，涂板后培養(yǎng)過夜(37℃)，而后選取單個菌落置于含有濃度為50 μg/mL的Amp LB培養(yǎng)基中(5 μL)，振蕩培養(yǎng)10 h(37℃)，最后利用Easy Pure? Plasmid MiniPrep Kit對陽性克隆子進行質(zhì)粒的提取，質(zhì)粒送上海生物生工公司測序。

1.2.3 絕對定量PCR 利用絕對定量PCR(TaqMan探針法)檢測其樣品DNA，反應體系總體積為20 μL，其中10 μL TransStart?Probe qPCR Super Mix，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，熒光探針0.4 μL， ddH2O6.8 μL， DNA模板2 μL。反應程序：94℃預變性3 min，94℃變性5 s，57℃退火15 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。添加樣品后，置于Light Cycler480 Software Setup (Roche)中反應。

1.2.4 大青葉蟬不同發(fā)育歷期的內(nèi)共生菌感染率檢測 在室內(nèi)用水稻苗飼養(yǎng)大青葉蟬，獲得大青葉蟬的卵、若蟲、雌雄成蟲，清洗干凈后按照QIAGEN試劑盒說明書提取其DNA，然后用特異引物檢測卵、1～5齡若蟲、雌雄成蟲的內(nèi)共生菌感染率，分別檢測10頭，檢測2代。

1.2.5 大青葉蟬不同發(fā)育歷期的內(nèi)共生菌拷貝數(shù)的檢測 按照QIAGEN試劑盒說明書提取大青葉蟬卵、1～5齡若蟲、雌雄成蟲各發(fā)育歷期的DNA，然后用絕對定量PCR對其內(nèi)共生菌的拷貝數(shù)進行檢測。

1.2.6 大青葉蟬組織器官的內(nèi)共生菌拷貝數(shù)的檢測 利用乙酸乙酯立即殺死大青葉蟬成蟲后用酒精(75%)和無菌水清洗干凈，然后置于無菌且有0.9%氯化鈉溶液的凹玻片上，體視鏡下解剖出菌胞體、卵巢、精巢、腸、唾液腺，每種組織器官取3個樣品，每個樣品來自解剖3頭大青葉蟬，用PBS清洗后提取DNA。然后檢測樣品中S.muelleri和Sodalissp.的16S rDNA的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大青葉蟬不同發(fā)育歷期的內(nèi)共生菌感染率

經(jīng)檢測，在2代大青葉蟬的卵、1～5齡若蟲和成蟲各發(fā)育期均檢測到S.muelleri和Sodalissp.內(nèi)共生菌，且感染率為100%。

2.2 大青葉蟬不同發(fā)育歷期的內(nèi)共生菌拷貝數(shù)

如圖1所示，S.muelleri內(nèi)共生菌拷貝數(shù)在大青葉蟬5齡若蟲中最高，而Sodalissp.內(nèi)共生菌拷貝數(shù)在雌成蟲中最高，S.muelleri和Sodalissp的拷貝數(shù)在卵中最少。從卵到5齡若蟲，S.muelleri和Sodalissp.的拷貝數(shù)除在3齡若蟲階段有所下降外，其余階段隨著發(fā)育歷期的增加而增高。

圖1 大青葉蟬不同發(fā)育歷期S. muelleri和Sodalis sp. 的拷貝數(shù)

2.3 大青葉蟬不同組織器官的內(nèi)共生菌拷貝數(shù)

由表1可見，在大青葉蟬的卵巢、精巢、中腸、唾液腺、菌胞體中均檢測出S.muelleri和Sodalissp.，然而在不同的組織器官中其數(shù)量又存在差異。在菌胞體中S.muelleri和Sodalissp.的拷貝數(shù)均較高，但在雄蟲的腸及雌雄成蟲的唾液腺當中卻較少。

表1 大青葉蟬不同組織器官的內(nèi)共生菌拷貝數(shù)

3 討論

大部分的昆蟲體內(nèi)含有內(nèi)共生菌，且存在于昆蟲的各個發(fā)育歷期和組織器官。WANGKEEREE等[22]在檢測不同生長階段的網(wǎng)脈融莖葉蟬和其各組織器官，其內(nèi)共生菌BAMH存在于各發(fā)育期及其組織器官當中；廖珊等[23]試驗證實，在灰飛虱的生殖器官、消化道等中具有沃爾巴克氏體(Wolbachia)；陳吉強等[24]在煙粉虱MEAM1隱種的卵、若蟲和成蟲中檢測到CandidatusHamiltonella defensa、CandidatusProtiera aleyrodidarum和立克次氏體(Ricketsiasp.)3種內(nèi)共生菌，同時立克次氏體還存在于菌胞體以及一些器官中。NODA等[11]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)共生菌S.muelleri存在于黑尾葉蟬的菌胞及卵巢當中。該研究結(jié)果與前人研究一致，大青葉蟬的卵、若蟲、雌雄成蟲均感染了S.muelleri和Sodalissp，此外在菌胞體、卵巢、精巢、中腸、唾液腺中均檢測到2種內(nèi)共生菌，說明2種內(nèi)共生菌能通過大青葉蟬的雌蟲完成垂直傳播。

不同昆蟲體內(nèi)的共生菌，其作用有所不同，如蠐螬后腸中細菌群落，能為蠐螬提供必需的甾醇類物質(zhì)；種蠅(Hylemya)幼蟲的消化道內(nèi)的細菌能產(chǎn)生維生素B及其他重要的營養(yǎng)物質(zhì)，使幼蟲發(fā)育加快；蠟螟體內(nèi)共生菌能促進蠟的消化；白蟻消化道中的細菌能固定大氣中的氮，并為昆蟲的組織吸收利用[13]。甘蔗長蝽體內(nèi)的伯克霍爾德氏菌具有降解農(nóng)藥的作用[25]；立克次氏體可以提高煙粉虱各齡期的存活率、延長其成蟲壽命[26]；Cardinium可增加煙粉虱的雌性比例[27]。大青葉蟬體內(nèi)的共生菌S.muelleri可合成宿主需要的氨基酸[28]，然而Sodalissp.對宿主的作用還需進一步研究。

大青葉蟬的不同發(fā)育歷期及不同器官和組織所攜帶的S.muelleri、Sodalissp.內(nèi)共生菌的拷貝數(shù)不同，從卵到2齡其內(nèi)共生菌S.muelleri、Sodalissp.的拷貝數(shù)呈上升趨勢，然而在3齡時降低，從4齡開始又增加，2種內(nèi)共生菌在菌胞體中的含量最多，其次是雌雄生殖器官，說明S.muelleri、Sodalissp.內(nèi)共生菌在大青葉蟬體內(nèi)有一定的動態(tài)變化規(guī)律。為進一步研究內(nèi)共生菌與寄主之間的相互關(guān)系和利用內(nèi)共生菌對大青葉蟬進行生物防治提供參考。

4 結(jié)論

大青葉蟬體內(nèi)和不同組織及器官(菌胞體、卵巢、精巢、中腸、唾液腺)中均檢測到S.muelleri和Sodalissp.內(nèi)共生菌，S.muelleri內(nèi)共生菌在5齡若蟲中拷貝數(shù)最高，Sodalissp.內(nèi)共生菌在雌蟲中最多，2種內(nèi)共生菌在卵中均最少；2種內(nèi)共生菌均在菌胞體中的拷貝數(shù)最高，在雄蟲的腸、雌雄唾液腺當中卻很少。