饒家瑞， 周玉鋒*， 張金鋒， 張 欣， 余用秀

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】茶輪斑病是由擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、新擬盤多毛孢屬(Neopestalotiopsis)和假擬盤多毛孢屬(Pseudopestalotiopsis)的多種病原引起的茶樹葉部病害[1-4]，感病葉片呈褐色不規(guī)則圈狀大斑[5]。茶輪斑病發(fā)生為害嚴(yán)重茶園可導(dǎo)致茶葉大量減產(chǎn)。因此，針對茶輪斑病病原篩選具有抑菌活性的生物農(nóng)藥，對保障茶產(chǎn)業(yè)健康綠色發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】采用化學(xué)農(nóng)藥、生物農(nóng)藥和生防菌對不同地區(qū)茶輪斑病的抑制活性研究較多[6-8]。郭世保等[9]研究顯示，25%阿米西、10%世高水分散粒劑、25%丙環(huán)唑、75%百菌清、50%苯菌靈、70%甲基托布津和80%多菌靈對茶輪斑病均有不同程度的抑菌活性，并以25%阿米西的EC50最佳，為 0.094 7 μg/mL；董照鋒[10]研究表明，6%春雷霉素可濕性粉劑、枯草芽孢桿菌和戊唑醇對茶輪斑病的菌絲生長與孢子萌發(fā)有較好抑制效果；楊文等[11]研究檸檬醛和香葉醇天然產(chǎn)物對茶輪斑病病原菌(P.theae)抑制活性的結(jié)果表明，檸檬醛和香葉醇在500 mg/L濃度下的抑菌活性均高于50%；洪永聰?shù)萚12]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢菌株TL2對茶輪班病的菌絲生長和分生孢子形成均有較好的抑制效果，且其抗菌活性主要是枯草芽孢菌產(chǎn)生的蛋白改變了茶樹體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活性，從而調(diào)節(jié)茶樹活性氧代謝平衡達(dá)到限制茶輪斑病擴(kuò)散的目的。【研究切入點(diǎn)】針對茶園發(fā)生的茶輪斑病，篩選復(fù)配增效作用明顯的生物農(nóng)藥組合用于茶區(qū)茶輪斑病的生物防控?！緮M解決的關(guān)鍵問題】生物農(nóng)藥具有低毒、可降解優(yōu)點(diǎn)，對病害防控具有廣闊的應(yīng)用前景[13]。對甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6、木霉菌、中生菌素、枯草芽孢桿菌和四霉素5種生物農(nóng)藥的抑菌活性進(jìn)行初篩選，并挑選其中活性較優(yōu)生物農(nóng)藥進(jìn)行復(fù)配，再采用菌絲速率生長法，測定活性較高生物農(nóng)藥按不同比例復(fù)配混合后的抑菌活性及室內(nèi)毒力強(qiáng)度。以期從中篩選出增效作用明顯的配方組合，為茶輪斑病的生物防控和茶產(chǎn)業(yè)的綠色健康發(fā)展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶輪斑病病原菌 茶輪斑病病原菌為張欣等[14]于2020年7月從貴州省銅仁市石阡縣采集，經(jīng)單孢分離、結(jié)合形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究，將分離病原鑒定為Pestalotiopsistrachicarpicola，并根據(jù)室內(nèi)回接，驗(yàn)證了其致病性。病原菌由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.1.2 藥劑 5種生物農(nóng)藥和陽性對照藥(CK1)的名稱、成分含量、劑型及生產(chǎn)廠家見表1。無水乙醇，購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；吐溫80，購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；PDA培養(yǎng)基，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂粉，購買于成都?xì)W恩瑞思化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為化學(xué)純或分析純，購于上海安耐吉化學(xué)試劑有限公司。藥品稱量，均在Sarfori-us型電子天平(精度0.000 1 g)上完成。

表1 5種生物農(nóng)藥的基本信息

1.1.3 儀器 超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，高溫蒸汽滅菌鍋(上海沉匯儀器有限公司)，BSA224S-CW電子天平，BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜，Mill-Q型超純水制備儀，20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液槍等儀器。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1) 5種生物農(nóng)藥對茶輪斑病的抑菌活性試驗(yàn)。以5種生物農(nóng)藥為試驗(yàn)對象，多抗霉素為陽性對照，吐溫80滅菌水為空白對照，共設(shè)7個(gè)處理，各濃度處理3次重復(fù)。根據(jù)表1生物農(nóng)藥分別設(shè)為5個(gè)處理，陽性對照藥多抗霉素(CK1)，空白對照等量吐溫80滅菌水(CK2)。

2) 抑菌活性較好生物農(nóng)藥復(fù)配的聯(lián)合毒力試驗(yàn)。參照向曉龍等[15-16]的藥劑復(fù)配設(shè)計(jì)方法，選取試驗(yàn)1)中抑菌活性較好的中生菌素(A)和四霉素(B)按不同比例進(jìn)行混合復(fù)配，試驗(yàn)共設(shè)10個(gè)處理，各濃度處理3次重復(fù)。處理1，A∶B為9∶1；處理2，A∶B為8∶2；處理3，A∶B為7∶3；處理4，A∶B為6∶4；處理5，A∶B為5∶5；處理6，A∶B為4∶6；處理7，A∶B為3∶7；處理8，A∶B為2∶8；處理9，A∶B為1∶9；處理10，為空白對照等量吐溫80滅菌水(CK3)。

1.2.2 不同濃度各生物農(nóng)藥抗茶輪斑病的EC50測定

1) PDA培養(yǎng)基配制。按照購買的PDA培養(yǎng)基使用配方，在3 L清水中依次加入PDA粉120 g、瓊脂粉39 g，在攪拌狀態(tài)下煮沸4 min停火，冷卻10 min，最后以每瓶45 mL倒入100 mL的錐形瓶中封口，在121℃條件下高壓滅菌 20 min，冷卻備用。

2) 藥液配制。將200 μL吐溫80加入滅菌后的200 mL滅菌水中，攪拌均勻。分別稱取各生物農(nóng)藥5 mg、2.5 mg、1.25 mg、0.675 mg和0.337 5 mg，并分別加入1 mL吐溫80滅菌水混勻，現(xiàn)加入4 mL滅菌水，使50 mL PDA培養(yǎng)基中各生物農(nóng)藥的最終濃度分別為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL，再將含有各待測生物農(nóng)藥的PDA培養(yǎng)基平均倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中冷卻備用。

3) 病原接種。在消毒后的超凈工作臺上，用打孔器在事先活化好的茶輪斑病菌落邊緣打孔，制成直徑為4.0 mm的菌餅，然后用無菌接種針將菌餅接種到含有對應(yīng)生物農(nóng)藥的培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿放于25℃、80%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。待空白對照組菌絲生長至6.0 cm左右時(shí)，采用十字交叉法測量菌餅直徑[11]，用菌絲生長速率法測定各濃度生物農(nóng)藥對茶輪斑病的抑菌活性，篩選抗茶輪斑病活性較高的生物農(nóng)藥。以生物農(nóng)藥濃度的對數(shù)為自變量(x)，相對抑制率為因變量(y)，取對數(shù)得到生物農(nóng)藥對茶輪斑病的線性回歸方程，計(jì)算各生物農(nóng)藥的抑制率、抑制中質(zhì)量濃度EC50及相關(guān)系數(shù)(R2)。根據(jù)EC50判斷生物農(nóng)藥的毒力大小。即生物農(nóng)藥的EC50越小，其對茶輪斑病病原菌的毒力越強(qiáng)。

I= [(C-T)/(C-0.4)]× 100%

式中，I為抑制率，C為空白對照的菌絲直徑，T為藥物處理組菌絲直徑。

1.2.3 高活性生物農(nóng)藥復(fù)配對P.trachicarpicola的EC50測定 采用菌絲生長速率法[18]，測定中生菌素和四霉素在100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL濃度下，按不同比例復(fù)配藥液對該病原的抑制率，采用1.2.2中公式計(jì)算出對應(yīng)濃度下的抑制率，再對生物農(nóng)藥濃度取對數(shù)與其相應(yīng)抑制率做線性回歸方程，從而得出其EC50。

1.2.4 復(fù)配藥劑的共毒系數(shù) 采用菌絲生長速率法測定按不同比例復(fù)配混合生物農(nóng)藥的抑菌活性及室內(nèi)毒力強(qiáng)度。利用SUN等[17]的毒力評判法計(jì)算復(fù)配農(nóng)藥的共毒系數(shù)CTC(co-toxicity coefficient)，并以CTC值評判2種藥劑的聯(lián)合毒力作用。CTC值小于80為拮抗作用，大于120為增效作用，80～120為相加作用。計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和DPS 7.05對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種生物農(nóng)藥對 P. trachicarpicola的抑制率及毒力強(qiáng)度

2.1.1 不同濃度生物農(nóng)藥對P.trachicarpicola的抑制率 由表2可知，5種生物農(nóng)藥在100～6.75 μg/mL濃度下對P.trachicarpicola的抑制率，均隨藥劑濃度的減小而降低，且各濃度間差異均達(dá)極顯著。說明，抑制率和其對應(yīng)藥物的濃度均呈較好線性關(guān)系，測定EC50的可信度高。在5種生物農(nóng)藥中，以枯草芽孢桿菌對該病原的抑制率最好，在100～6.75 μg/mL濃度下的抑制率為94.44%～61.42%，比同梯度濃度對照藥多抗霉素高27.77～51.23百分點(diǎn)；中生菌素其次，抑制率為95.06%～28.09%，比同梯度濃度對照藥多抗霉素高28.39～17.90百分點(diǎn)；甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6第3，抑制率為79.94%～35.19%，比同梯度濃度對照藥多抗霉素高13.27～25.00百分點(diǎn)；四霉素與對照藥多抗霉素相當(dāng)；木霉菌在各梯度濃度下的抑制率略低于陽性對照藥。

表2 不同濃度下5種生物農(nóng)藥對茶輪斑病病原(P. trachicarpicola)的抑制率

2.1.2 毒力回歸方程 從表3可知，通過擬合得到的5種生物農(nóng)藥對茶輪斑病病原(P.trachicarpicola)的毒力方程為y甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6=0.994 7x+3.814 2(R2=0.993 1)，y木霉菌=1.805 7x+1.723 1(R2=0.960 6)，y中生菌素=1.823 5x+2.845 4(R2=0.978 6)，y枯草芽孢桿菌=1.066 2x+4.349 6(R2=0.980 6)，y四霉素=1.290 4x+2.876 3(R2=0.996 4)，y多抗霉素=1.405 8x+ 2.651 6(R2=0.995 6)，相關(guān)系數(shù)均>0.95，表明5種生物農(nóng)藥及對照藥多抗霉素的濃度與抑制率間均存在良好的線性關(guān)系。

2.1.3 毒力強(qiáng)度 由表3看出，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6、中生菌素、枯草芽孢桿菌和四霉素的EC50分別為15.56 μg/mL、15.19 μg/mL、4.07 μg/mL和44.24 μg/mL，分別比陽性對照藥多抗霉素(46.83 μg/mL)減少用藥量31.27 μg/mL、31.64 μg/mL、42.76 μg/mL和2.59 μg/mL。說明，枯草芽孢桿菌的毒力強(qiáng)度最大，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6和中生菌素其次，四霉素稍差，且效果均優(yōu)于對照藥多抗霉素。

表3 5種生物農(nóng)藥對茶輪斑病病原(P. trachicarpicola)的毒力回歸方程及EC50

2.2 中生菌素和四霉素復(fù)配藥劑對P. trachicarpicola的抑制率及毒力強(qiáng)度

2.2.1 復(fù)配藥劑對P.trachicarpicola的抑制率 由表4可知，在100 μg/mL濃度下，9種不同比例復(fù)配藥劑對P.trachicarpicola的抑制率以處理1最高，為90.97%；處理3次之，為89.58%；處理2第3，為89.24%。處理1除與處理2～5差異不顯著外，與處理6～9差異極顯著。雖然隨著四霉素在復(fù)配藥劑配方中的占比率增加，對P.trachicarpicola的抑制率呈依次緩慢下降趨勢，但仍高于四霉素在100 μg/mL時(shí)的抑制率(65.74%)。說明，復(fù)配對藥劑活性的提升具有一定作用。

表4 5種生物農(nóng)藥(100 μg/mL)對茶輪斑病病原(P. trachicarpicola)的抑制率

2.2.2 復(fù)配藥劑對P.trachicarpicola的室內(nèi)毒力強(qiáng)度 從表5可知，A∶B為9∶1復(fù)配藥劑的抑制活性最佳，EC50為12.03 μg/mL；A∶B為8∶2復(fù)配藥劑次之，EC50為16.34 μg/mL；隨著四霉素在復(fù)配藥劑中的占比不斷增加，復(fù)配藥劑的EC50呈上升趨勢。當(dāng)A∶B為1∶9時(shí)，其EC50達(dá)30.95 μg/mL，但仍然低于四霉素單劑EC50的毒力值44.24 μg/mL。9種復(fù)配藥劑的相關(guān)系數(shù)均大于0.95，說明復(fù)配藥劑的濃度與抑制率間均存在良好的線性關(guān)系，結(jié)果可信。

2.2.3 復(fù)配藥劑的共毒系數(shù)及聯(lián)合毒力強(qiáng)度 從表5看出，在中生菌素和四霉素復(fù)配的9種藥劑中，處理1、處理2、處理3和處理4的聯(lián)合毒力強(qiáng)度為增效，共毒系數(shù)依次為310.51、197.82、147.99和134.52；處理5和

表5 中生菌素和四霉素復(fù)配藥劑的毒力回歸方程、EC50、共毒系數(shù)及聯(lián)合毒力

處理6為相加，共毒系數(shù)為117.70和97.80；處理7、處理8和處理9為拮抗，共毒系數(shù)依次為77.83、63.13和53.76。說明，A∶B=9∶1復(fù)配藥劑的增效作用最明顯，可以嘗試用于田間茶輪斑病的生物防控，復(fù)配藥劑的聯(lián)合毒力強(qiáng)度整體隨四霉素占比增加呈下降趨勢，證明中生菌素在復(fù)配藥劑中的占比對其藥劑活性的影響較大。

3 討論

茶輪斑病可由多種病原菌引起，為針對不同病原有效地進(jìn)行茶園防控，洪永聰?shù)萚12]研究表明，枯草芽孢菌株TL2對茶輪斑病有較好的抑制效果。因此，以茶輪斑病病原(P.trachicarpicola)為目標(biāo)菌種，用甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6、木霉菌、中生菌素、枯草芽孢桿菌和四霉素5種生物農(nóng)藥對其EC50進(jìn)行篩選，選擇活性較好的中生菌素和四霉素按照不同比例進(jìn)行復(fù)配，并測試不同配比復(fù)配組合的EC50。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6、木霉菌、中生菌素、枯草芽孢桿菌和四霉素5種生物農(nóng)藥在100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL濃度下對茶輪斑病病原(P.trachicarpicola)的抑制率均隨藥劑濃度的減小而降低，且各濃度間差異均達(dá)極顯著。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6、中生菌素、枯草芽孢桿菌和四霉素的EC50分別為15.56 μg/mL、15.19 μg/mL、4.07 μg/mL和44.24 μg/mL，分別比陽性對照藥多抗霉素(46.83 μg/mL)減少用藥量31.27 μg/mL、31.64 μg/mL、42.76 μg/mL和2.59 μg/mL。即5種生物農(nóng)藥的EC50以枯草芽孢桿菌最低，為4.07 μg/mL；中生菌素其次，為15.19 μg/mL；甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6第3，為15.56 μg/mL。

中生菌素和四霉素復(fù)配藥劑在100 μg/mL濃度下對P.trachicarpicola的抑菌活性測定結(jié)果顯示，9種復(fù)配藥劑組合中，以中生菌素∶四霉素為9∶1藥劑對茶輪斑病病原菌的抑制率最高，為90.97%；中生菌素∶四霉素為7∶3次之，為89.58%；中生菌素∶四霉素為8∶2第3，為89.24%。雖然隨著四霉素在復(fù)配藥劑組合中的占比率增加，其對茶輪斑病病原菌的抑制率呈依次緩慢降低趨勢，但仍然高于四霉素在100 μg/mL時(shí)對P.trachicarpicola的抑制率(65.74%)。說明，復(fù)配組合對藥劑活性的提升具有一定作用。

根據(jù)SUN等[17]的毒力評判方法計(jì)算復(fù)配組合的共毒系數(shù)(CTC)。以CTC值評判中生菌素和四霉素2種藥劑的聯(lián)合毒力作用，CTC<80為拮抗作用，CTC>120為增效作用，CTC為80～120為相加作用。9種不同復(fù)配藥劑的EC50測定結(jié)果表明，中生菌素∶四霉素為9∶1復(fù)配組合藥劑對P.trachicarpicola的抑制活性最佳，EC50為12.03 μg/mL；中生菌素︰四霉素為8∶2其次，EC50為16.34 μg/mL；中生菌素∶四霉素為7∶3第3，EC50為19.25 μg/mL。中生菌素∶四霉素為(9～6)∶(1～4)復(fù)配藥劑的聯(lián)合毒力均大于120，表現(xiàn)為藥劑增效，并以中生菌素∶四霉素為9∶1的聯(lián)合毒力最大，為310.51，表現(xiàn)出較好的藥劑增效作用。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，中生菌素∶四霉素為9∶1復(fù)配組合的EC50(12.03 μg/mL)均低于單一中生菌素(15.19 μg/mL)和四霉素(44.24 μg/mL)，其共毒系數(shù)為310.51>120，具有增效作用，但還應(yīng)進(jìn)一步在田間開展藥效試驗(yàn)進(jìn)行評價(jià)。因此，篩選對茶輪斑病抑制效果明顯的復(fù)配生物農(nóng)藥組合，對茶園減施化學(xué)農(nóng)藥用量、降低農(nóng)藥殘留和提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。