卿海輝，張小舟，胡敏，賀茂林

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療給骨肉瘤的治療帶來了新的希望。研究發(fā)現(xiàn)miRNA影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展；miR-301b通過靶向頭帕腫瘤綜合征蛋白（Cylindromatosis，CYLD）促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖；miR-301b在骨肉瘤腫瘤組織與外周血中上調(diào)表達(dá)。但miR-301b-3p其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制尚不清楚。第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）是一個(gè)抑癌基因，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的多條通路，其異常表達(dá)與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，PTEN能作為惡性腫瘤治療中的潛在靶點(diǎn)。有研究報(bào)道PTEN基因啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致的PTEN基因失活可能參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。DJ-1又名帕金森病蛋白7（PARK7），其可通過增加PTEN表達(dá)影響骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。但miR-301b-3p是否通過PTEN影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡還尚未清楚。本研究在2019年3—9月開展，旨在確定miR-301b-3p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的影響及其機(jī)制是否與PTEN相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人成骨細(xì)胞（hFOB）和骨肉瘤細(xì)胞U2OS、MG63購自美國菌種保藏中心；杜爾伯格氏伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基（DMEM）購自美國Gibico；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒購自美國Sigma；Trizol、熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組人成骨細(xì)胞hFOB和骨肉瘤細(xì)胞U2OS、MG63用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞U2OS，將miRNA抑制物陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、miR-301b-3p抑制物（anti-miR-301b-3p）轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞中，記為anti-miR-NC組、anti-miR-301b-3p組；將anti-miR-301b-3p分別與小干擾RNA陰性對(duì)照（si-NC）、PTEN小干擾RNA（si-PTEN）共轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞，記為anti-miR-301b-3p+si-NC組、anti-miR-301b-3p+si-PTEN組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-301b-3p表達(dá)水平提取hFOB細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞U2OS、MG63及各組U2OS細(xì)胞的總RNA，合成cDNA后進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量用2法計(jì)算。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性各組U2OS細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組U2OS細(xì)胞，按試劑盒說明操作，最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析凋亡情況。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平提取總蛋白，進(jìn)行電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)至PVDF，封閉后加入細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（P21）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl相關(guān)X蛋白（Bax）、PTEN等一抗4℃孵育過夜；洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，測(cè)各條帶吸光度值。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-301b-3p對(duì)PTEN的靶向調(diào)控將PTEN野生型熒光素酶報(bào)告載體（WT-PTEN）和PTEN突變型熒光素酶報(bào)告載體（MUT-PTEN）分別與miR-NC和miR-301b-3p共轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞，按說明書操作檢測(cè)U2OS細(xì)胞的熒光素酶活性。將anti-miR-NC、anti-miR-301b-3p、miRNC、miR-301b-3p分別轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞中，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 miR-301b-3p在人成骨細(xì)胞hFOB和骨肉瘤細(xì)胞U2OS、MG63中的表達(dá)

與人成骨細(xì)胞hFOB相比，骨肉瘤細(xì)胞U2OS、MG63中miR-301b-3p表達(dá)水平 顯 著 升 高［（0.89±0.09），（0.70±0.07）比（0.20±0.02），

F=

255.963，

P

＜0.05］。

2.2 抑制miR-301b-3p表達(dá)對(duì)細(xì)胞U2OS增殖、凋亡的影響

細(xì)胞活性在不同組間、不同時(shí)間點(diǎn)間、組間×?xí)r間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=83.774，

P

＜0.001；

F

=65.178，

P

＜0.001；

F

=63.286，

P

＜0.001）；轉(zhuǎn)染anti-miR-301b-3p的U2OS細(xì)胞相較于anti-miR-NC，miR-301b-3p表達(dá)水平顯著降低，U2OS細(xì)胞的活性以及Cyclin D1、Bcl-2表達(dá)水平降低，而凋亡率以及P21、Bax表達(dá)水平顯著升高（

P

＜0.05）（圖1，表1，表2）。

表1 抑制miR-301b-3p表達(dá)對(duì)U2OS增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響/±s

表2 抑制miR-301b-3p表達(dá)對(duì)U2OS增殖、凋亡的影響/±s

圖1 抑制miR-301b-3p表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞（U2OS）增殖、凋亡的影響：A為抑制miR-301b-3p表達(dá)后U2OS細(xì)胞凋亡；B為抑制miR-301b-3p表達(dá)后相關(guān)蛋白表達(dá)

可見，抑制miR-301b-3p表達(dá)抑制細(xì)胞U2OS增殖、促進(jìn)凋亡。

2.3 miR-301b-3p靶向、調(diào)控PTEN

starBase軟件預(yù)測(cè)到PTEN與miR-301b-3p存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。miR-301b-3p與WT-PTEN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞U2OS的熒光素酶活性顯著降低（

P

＜0.05）（表3）。過表達(dá)miR-301b-3p可降低PTEN表達(dá)水平［（0.10±0.01）比（0.36±0.03），

t

=24.666，

P

＜0.05］；而抑制miR-301b-3p表達(dá)可提高PTEN表達(dá)水平［（0.69±0.07）比（0.35±0.03），

t

=13.393，

P

＜0.05］（圖2B）?？梢?，miR-301b-3p可靶向調(diào)控PTEN的表達(dá)。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/±s

圖2 miR-301b-3p靶向調(diào)控第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）：A為PTEN與miR-301b-3p的互補(bǔ)序列；B為PTEN蛋白表達(dá)

2.4 抑制PTEN表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對(duì)細(xì)胞U2OS增殖的抑制作用

與anti-miR-301b-3p+si-NC組相比，anti-miR-301b-3p+si-PTEN組PTEN、P21表達(dá)水平顯著降低，Cyclin D1表達(dá)水平和細(xì)胞活性顯著升高（

P

＜0.05）（圖3，表4）。可見，抑制PTEN表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對(duì)細(xì)胞U2OS增殖的抑制作用。

表4 抑制PTEN和miR-301b-3p表達(dá)對(duì)U2OS增殖的影響/±s

圖3 抑制PTEN和miR-301b-3p表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響

2.5 抑制PTEN表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p表達(dá)對(duì)細(xì)胞U2OS凋亡的促進(jìn)作用

與anti-miR-301b-3p+si-NC組相比，anti-miR-301b-3p+si-PTEN組Bcl-2表達(dá)水平升高，而Bax表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率降低（

P

＜0.05）（圖4，表5）?？梢?，抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡的作用。

表5 抑制PTEN表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響/±s

圖4 抑制PTEN表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨肉瘤具有侵襲性強(qiáng)、惡性程度高、進(jìn)展快、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類的健康，亟需新的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)miR-301b在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，可通過抑制Kruppel樣因子4（Kruppellike Factor 4，KLF4）的表達(dá)促進(jìn)肝癌的遷移。miR-301b-3p通過靶向作用于MYB與CYLD促進(jìn)巨噬細(xì)胞刺激因子誘導(dǎo)的單核細(xì)胞自噬。以上結(jié)果表明miR-301b-3p參與調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展，還有研究用miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-301a-3p在人骨肉瘤細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)。本研究通過檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中miR-301a-3p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-301b-3p在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相符。為進(jìn)一步了解miR-301a-3p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，本研究轉(zhuǎn)染miR-301a-3p抑制表達(dá)載體，結(jié)果顯示，骨肉瘤U2OS細(xì)胞的活性降低，而凋亡率升高；說明抑制miR-301b-3p表達(dá)抑制U2OS細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，抑制miR-301b-3p表達(dá)可提高p21、Bax表達(dá)水平，降低CyclinD1、Bcl-2表達(dá)水平；進(jìn)一步說明抑制miR-301b-3p表達(dá)可抑制U2OS細(xì)胞的惡性增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，PTEN可通過提高半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-3、caspase-7、caspase-9活性，誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡。說明PTEN影響骨肉瘤的發(fā)展，與骨肉瘤的進(jìn)展有關(guān)。還有研究報(bào)道PTEN可作為靶基因被miRNA調(diào)控而影響腫瘤的進(jìn)展。如過表達(dá)miR-155可通過負(fù)調(diào)控PTEN，增強(qiáng)磷脂酰肌醇激酶（PI3K）通路信號(hào)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。miR-365通過靶向PTEN抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。miR-214-3p通過靶向PTEN，活化蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）通路，抑制骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。然而，miR-301b-3p是否靶向PTEN及是否通過調(diào)控PTEN影響骨肉瘤的進(jìn)展還尚未可知，本研究通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到PTEN與miR-301b-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-301b-3p可靶向調(diào)控PTEN的表達(dá)；且同時(shí)抑制PTEN和miR-301b-3p表達(dá)后，U2OS細(xì)胞活性顯著升高，而U2OS細(xì)胞凋亡率顯著降低；說明抑制PTEN表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-301b-3p對(duì)細(xì)胞U2OS增殖的抑制和凋亡促進(jìn)作用。提示，miR-301b-3p可能通過調(diào)控PTEN影響骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，抑制miR-301b-3p表達(dá)可能通過調(diào)控PTEN抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。