王超，姜紅春，劉丹

在兒童早期防治成人期疾病已經(jīng)成為世界范圍的熱點(diǎn)和趨勢(shì)，新生兒體質(zhì)量過(guò)低可能會(huì)導(dǎo)致缺氧缺血性腦?。℉IE）。HIE是在圍生期窒息引起的腦血流減少導(dǎo)致的腦損傷。目前我國(guó)新生兒HIE發(fā)病率高達(dá)3%～10%，雖然因地區(qū)不同而不同，但由此引起的行為障礙嚴(yán)重影響我國(guó)人口素質(zhì)的提高。促紅細(xì)胞生成素（EPO）作為一種能夠調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成的細(xì)胞因子，目前可以由人工合成與天然相同氨基酸序列的糖蛋白，其能緩解腦部損傷，降低相關(guān)凋亡蛋白的合成保護(hù)HIE病人的腦神經(jīng)細(xì)胞。但目前關(guān)于EPO對(duì)缺氧缺血后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制尚不能完全統(tǒng)一。2019年1—8月進(jìn)行本研究，旨在觀察EPO對(duì)低出生體質(zhì)量新生大鼠缺氧缺血后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，以期了解為臨床研發(fā)HIE新藥提供數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

低出生體質(zhì)量（LBW）新生SD大鼠80只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（4.0±0.2）g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（粵）2018-0002］。飼養(yǎng)溫度20～25℃，相對(duì)濕度50%～65%，本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 藥物與試劑

EPO（純度＞99.9%）購(gòu)自上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購(gòu)自天津科密歐有限公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體（貨號(hào)sc-7382，批號(hào)20190201）、Bcl-2相關(guān)X（Bax）抗體（貨號(hào)sc-7480，批號(hào)20190301）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）（1∶500，貨號(hào)201872169）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（貨號(hào)2018630258）購(gòu)自武漢華聯(lián)科有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、HRP羊抗鼠IgG等二抗購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 分組及模型建立將80只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以隨機(jī)數(shù)字表法選20只為空白對(duì)照組，將余下大鼠采用結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈并吸入80 mL/L氧氣2 h制作新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）動(dòng)物模型。具體操作如下：讓大鼠吸入乙醚，消毒后從頸左側(cè)切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合皮膚。2 h后放置于缺氧艙內(nèi)，通入氧體積分?jǐn)?shù)為80 mL/L持續(xù)2 h，待大鼠蘇醒后返回母鼠身旁哺乳喂養(yǎng)。

1.3.2 藥物干預(yù)完成大鼠模型建立后，低劑量EPO組和高劑量EPO組大鼠分別腹腔注射EPO，注射劑量分別為2 500 IU/kg和5 000 IU/kg，每日一次，連續(xù)注射7 d，模型組和空白對(duì)照組分別同時(shí)間注射等量生理鹽水。藥物使用劑量參考梁增紅研究。

1.3.3 檢測(cè)項(xiàng)目HE染色：將實(shí)驗(yàn)大鼠的腦組織經(jīng)甲醛固定，乙醛脫水處理制備石蠟標(biāo)本，采用LD-66實(shí)驗(yàn)室切片機(jī)（長(zhǎng)沙益廣制藥機(jī)械公司）進(jìn)行4 μm厚切片，HE染色后采用SG-51型正置型金相顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）在400倍光鏡觀察腎小球結(jié)構(gòu)。

TUNEL法檢測(cè)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡：取各組大鼠腦組織切片，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明要求書操作，DAB顯色后二甲苯固定，晾干，熒光封片試劑封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果：凋亡指數(shù)（%）=陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞×100%。

Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：取大鼠腦組織，消化后、提取總蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉，加入Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2等一抗孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記二抗，孵育2 h，將βactin作為內(nèi)參蛋白，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（色列DNR公司）檢測(cè)分析蛋白條帶。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡：取大鼠腦組織，剪刀剪碎后制成細(xì)胞懸液，4℃離心5 min收集細(xì)胞；加入100 μL Binding Buffer重懸，加入5 μL Annexin V-FITC/PI工作液混勻；室溫避光孵育15 min，采用MoFlo XDP型流式細(xì)胞儀（賽默飛世爾科技有限公司）檢測(cè)大鼠后腦組織細(xì)胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-

t

檢驗(yàn)；

P

＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡

空白對(duì)照組中，神經(jīng)細(xì)胞密集、排列有序，層次清晰、分明；模型組中，神經(jīng)細(xì)胞細(xì)明顯腫脹壞死、空化、間隙增寬、大量細(xì)胞丟失且排列稀疏；低劑量EPO組中，部分細(xì)胞輕度水腫、空化、排列稀疏；高劑量EPO組中，少量細(xì)胞出現(xiàn)水腫、間隙增寬不明顯、細(xì)胞層次較為分明，排列有序。見圖1A。

圖1 大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡：A為HE染色圖（HE×400）；B為TUNEL法檢測(cè)（TUNEL×400）

2.2 TUNEL法檢測(cè)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡

空白對(duì)照組中，神經(jīng)細(xì)胞無(wú)凋亡；模型組中，神經(jīng)細(xì)胞大部分出現(xiàn)凋亡；低劑量EPO組中，部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，高劑量EPO組中，少量神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，見圖1B?？瞻讓?duì)照組、模型組、低劑量EPO組、高劑量EPO組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別為（10.21±2.00）%、（65.85±10.48）%、（40.32±5.22）%、（20.79±2.33）%，相比空白對(duì)照組，模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高（

P

＜0.05）；相比模型組，低劑量EPO組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低（

P

＜0.05）；相比低劑量EPO組，高劑量EPO組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低（

P

＜0.05）。

2.3 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

相比空白對(duì)照組，模型組大鼠腦組織Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（

P

＜0.05）；相比模型組，低劑量EPO組大鼠腦組織Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（

P

＜0.05）；相比低劑量EPO組，高劑量EPO組大鼠腦組織Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（

P

＜0.05）。見圖2、表1。

表1 各組小鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)/±s

圖2 各組小鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（Western blotting檢測(cè)）

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡

空白對(duì)照組、模型組、低劑量EPO組、高劑量EPO組大鼠后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別為（5.32±0.87）%、（22.36±4.52）%、（15.23±2.12）%、（10.36±1.98）%，相比空白對(duì)照組，模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例與正在凋亡的腦組織神經(jīng)細(xì)胞顯著升高（

P

＜0.05）；相比模型組，低劑量EPO組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例與正在凋亡的腦組織神經(jīng)細(xì)胞顯著降低（

P

＜0.05）；相比低劑量EPO組，高劑量EPO組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例與正在凋亡的腦組織神經(jīng)細(xì)胞顯著降低（

P

＜0.05）。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡

3 討論

EPO是一種調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)紅系祖細(xì)胞分為紅細(xì)胞使得紅細(xì)胞數(shù)量增加，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)養(yǎng)分的利用，同時(shí)EPO還具有非造血功能，是一種具有抗凋亡活性的細(xì)胞因子?？捎行Ь徑馊毖毖鯇?dǎo)致的腦損傷。李晶晶等研究表明EPO可以與EPOR的同源二聚體結(jié)合調(diào)節(jié)造血反應(yīng)，對(duì)缺血后的腦組織有一定的保護(hù)效果。目前臨床上將EPO作為腎性貧血的常規(guī)用藥，同時(shí)目前已有較多的研究證實(shí)EPO具有神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究通過(guò)HE染色觀察腦組織神經(jīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞細(xì)明顯腫脹壞死、空化、間隙增寬、大量細(xì)胞丟失且排列稀疏；使用EPO處理后的各組大鼠部分細(xì)胞輕度水腫、間隙增寬不明顯、細(xì)胞層次較為分明，排列有序，提示EPO對(duì)于改善大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞水腫現(xiàn)象具有十分積極的作用。同時(shí)本研究檢測(cè)了大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用EPO處理后的各組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率顯著下降，說(shuō)明EPO對(duì)于抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡也具有十分積極的作用。鞠飛等研究報(bào)道，EPO對(duì)于缺血血壓后神經(jīng)損傷具有一定程度的抑制作用，與本研究結(jié)論類似。一方面，EPO可以有效激活細(xì)胞內(nèi)的鈣離子通道，減輕谷氨酸毒性，促進(jìn)血管生成，從而增加大鼠腦內(nèi)缺血區(qū)的血流量及氧合作用；另一方面，EPO可阻止自由基釋放，影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和抗炎作用，從而對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)起到神經(jīng)保護(hù)作用。

研究顯示，細(xì)胞凋亡過(guò)程可受到多種基因的調(diào)控，而Caspase家族基因，如Caspase-3、Caspase-9是常見的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因之一。Caspase-9是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶，其作為啟動(dòng)子，處于激活的頂端，可參與啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡，Caspase-3則是凋亡的主要執(zhí)行者。Bcl-2家族基因也可以調(diào)控細(xì)胞的凋亡，其中最常見的包括Bcl-2和Bax。Bax是凋亡基因，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2則是抑凋亡基因，能夠抑制多種細(xì)胞毒因素所引發(fā)的細(xì)胞死亡，表現(xiàn)出抑制細(xì)胞凋亡的作用。張晶等指出，EPO可以通過(guò)抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，抑制新生大鼠腦組織中凋亡相關(guān)因子的表達(dá)。本研究在LBW新生HIBD大鼠中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論，結(jié)果顯示，相比模型組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPO處理后組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例與正在凋亡的腦組織神經(jīng)細(xì)胞顯著降低。同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，使用EPO處理后組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡細(xì)胞顯著減少，同時(shí)正在凋亡與即將凋亡的細(xì)胞百分比也顯著減少。這可能是因?yàn)?，EPO能夠作用于凋亡相關(guān)基因，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，最終達(dá)到抑制腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的目的。

綜上所述，EPO對(duì)于LBW新生大鼠缺氧缺血后腦神經(jīng)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制凋亡蛋白的表達(dá)并促進(jìn)抑凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)。但因EPO抑制新生大鼠缺氧后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡涉及的信號(hào)通路較多，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步探討信號(hào)通路在保護(hù)新生大鼠缺氧后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡的作用機(jī)制。