譚定春，秦惠何

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢，嚴重威脅人類的生命健康。腫瘤的發(fā)生發(fā)展受腫瘤微環(huán)境中多種因素的調(diào)控，這些因素包括細胞內(nèi)源性因子和外源性因素，如局部浸潤的免疫細胞、腫瘤細胞分泌的促炎因子等。淋巴細胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分，影響腫瘤的進展和預后，自然殺傷細胞（NK）是固有免疫細胞之一。結(jié)腸癌腫瘤組織中NK細胞數(shù)明顯低于臨近的正常組織，這說明腫瘤微環(huán)境中的調(diào)控因子不足以將NK細胞募集到腫瘤組織。2型人類表皮生長因子受體（HER2）是人類癌基因之一，在成人組織中幾乎不表達，而在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達。有研究顯示，結(jié)直腸癌中HER2表達升高，RNA干擾HER2表達可抑制癌細胞增殖；NK-92細胞聯(lián)合靶向HER2基因的siRNA可抑制卵巢癌細胞在體內(nèi)及體外增殖，提示HER2可能在NK細胞的局部浸潤中發(fā)揮調(diào)控作用。NK92細胞與NK細胞具有相似的表面分子特征和功能特點，是一種理想的腫瘤生物治療的細胞系。王洋研究顯示，半乳糖凝集素-9（galectin-9）基因可通過影響NK92細胞F-肌動蛋白（F-actind）的極化，調(diào)節(jié)NK92細胞的趨化引動。目前，HER2對NK細胞局部浸潤的影響還未知。鑒于此，本研究于2018年5—11月進行實驗，旨在探討HER2對結(jié)直腸癌NK細胞局部浸潤的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

杜爾伯格伊戈爾培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco；HER2和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體均購自美國CST；重組HER2購自美國R&D；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購自中國碧云天；凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂。

1.2 細胞及培養(yǎng)

人正常結(jié)腸上皮細胞（NCM460），人 結(jié) 直 腸 癌 細 胞（SW480、SW620、HT29）及人類NK92細胞均購自美國ATCC。NCM460、SW480、SW620和HT29細胞使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，NK92細胞用α最小必需培養(yǎng)基（α-MEM）完全培養(yǎng)基（含2 mmol L-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氫鈉、12.5%FBS和馬血清、0.02 mmol葉酸、0.2 mmol肌醇、100～200 U/mL重組IL-2和0.1 mmol 2-巰基乙醇），所有細胞均在5%體積分數(shù)二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western blotting

預冷RIPA裂解液（加蛋白酶抑制劑PMSF）提取生長至對數(shù)期的SW480、SW620和HT29細胞總蛋白，BCA試劑盒定量蛋白，蛋白變性后，每孔加40 μg上樣，依次經(jīng)10%SDSPAGE、轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，洗膜，將膜完全浸入按照1∶500稀釋的HER2及1∶1 000稀釋的內(nèi)參GAPDH溶液中，4℃搖床孵育過夜，洗膜，加1∶2 000稀釋的HRP標記的二抗，室溫孵育30～50 min，洗膜，ECL顯色，顯影、定影，待膠片晾干后掃描分析。使用Image J分析軟件對圖像進行灰度值分析。得出目的蛋白與內(nèi)參蛋白光密度值比值，即為蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.4 轉(zhuǎn)染

以1×10/孔接種生長至對數(shù)期的HT29細胞于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2 mL，使其在24 h內(nèi)細胞達70%～80%生長匯合度，參照Lipofectamine2000說明制備Lipo-2000-siRNA復合物，其中siRNA包括陰性對照siRNA及HER2的特異性siRNA，將復合物加入培養(yǎng)孔中，設(shè)置加等體積脂質(zhì)體的空白組，輕輕混勻，37℃、5%二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱，常規(guī)孵育4～6 h，更換含血清及雙抗的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后進行后續(xù)實驗。siRNA序列如下：HER2 siRNA正向引物5'-CUGGUGUAUGCAGAUUGCCUU-3'，反向引物5'-GGCAAUCUGCAUACACCAGUU-3'；陰 性 對 照siRNA正 向 引 物5'-CUUGUAUGGGCAGAUUGCCUU-3'，反向引物5'-GGCAAUCUGCCCAUACAAGUU-3'。

1.5 HT29細胞培養(yǎng)上清HER2的含量

HER2的特異性siRNA轉(zhuǎn)染HT29細胞48 h，收集腫瘤細胞培養(yǎng)上清，采用ELISA試劑盒檢測上清中HER2的含量。

1.6 趨化實驗

將100 μL的NK92細胞（濃度2×10/mL）置于Transwell小室上層，Transwell小室下層加25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的rhHER2或600 μL的HT29細胞培養(yǎng)上清，將培養(yǎng)板放于37℃孵箱中4 h，用于趨化實驗。收集下室細胞使用細胞計數(shù)板計數(shù)。應用趨化指數(shù)（MI）評估：MI=趨化細胞數(shù)/自發(fā)趨化細胞數(shù)（無趨化因子）。此外，使用7.5 ng/mL的IL-12作為NK細胞趨化作用的陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 三株結(jié)直腸癌細胞HER2基因表達

以正常結(jié)腸NCM460細胞為對照細胞，Western blotting檢測結(jié)直腸癌SW480、SW620和HT29細胞HER2蛋白表達，結(jié)果如圖1所示。

圖1 SW480、SW620和HT29細胞HER2的蛋白表達

三株結(jié)直腸癌細胞HER2蛋白表達均明顯高于NCM460細 胞［（0.104±0.011）、（0.141±0.015）、（0.243±0.018）比（0.018±0.003），

F

=153.526，

P

＜0.05］，由于在HT29細胞表達最高，因此選擇HT29細胞為后續(xù)研究對象。

2.2 HER2小干擾RNA轉(zhuǎn)染HT29細胞效果

轉(zhuǎn)染si-HER2的HT29細胞HER2蛋白表達［（0.467±0.046）、（0.506±0.053）比（0.101±0.012），

F

=88.628，

P

＜0.05］及培養(yǎng)上清HER2含量［（74.7±4.6）pg/mL比（125.3±10.1）pg/mL、（121.6±9.3）pg/mL，

F

=34.153，

P

＜0.05］均明顯低于對照組和NC組。見圖2。

圖2 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染si-HER2的HT29細胞HER2蛋白表達

2.3 重組HER2對NK92細胞趨化運動的影響

25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的重組HER2處理NK92細胞4 h，IL-12作為陽性對照，細胞趨化檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，IL-12組遷移指數(shù)明顯升高［（1.00±0.10）比（2.26±0.24），

P

＜0.05］，而100 ng/mL重組HER2組遷移指數(shù)明顯降低［（1.00±0.10）比（0.63±0.09），

P

＜0.05］。25 ng/mL和50 ng/mL的重組HER2組遷移指數(shù)與對照組差異無統(tǒng)計學意義［（1.00±0.10）比（1.11±0.12）、（1.04±0.15），

P

＞0.05］。

2.4 抑制HER2表達對NK92細胞趨化運動的影響

si-HER2轉(zhuǎn)染HT29細胞后，收集腫瘤上清對NK92細胞進行趨化實驗，結(jié)果顯示，與對照組、NC組比較，si-HER2組遷移指數(shù)明顯升高［（1.00±0.11），（1.37±0.10）比（1.95±0.16），

F

=43.264，

P

＜0.05］。

2.5 重組HER2對NK92細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的重組HER2處理NK92細胞4 h，IL-12作為陽性對照，Western blotting檢測NK92細胞中β-catenin蛋白表達，結(jié)果如圖3所示。與對照組比較，IL-12組βcatenin蛋白水平明顯降低［（0.687±0.059）比（0.312±0.025），

P

＜0.05］，而100 ng/mL重 組HER2組βcatenin蛋白水平明顯升高［（0.687±0.059）比（1.118±0.097），

P

＜0.05］。25 ng/mL和50 ng/mL的 重 組HER2組β-catenin蛋白水平與對照組差異無統(tǒng)計學意 義［（0.687±0.059）比（0.692±0.061），（1.118±0.097），

P

＞0.05］。

圖3 各組NK92細胞β-catenin蛋白表達條帶

2.6 抑制HER2對NK92細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

si-HER2轉(zhuǎn)染HT29細胞后，收集腫瘤上清，Western blotting檢測β-catenin蛋白表達，結(jié)果如圖4所示，si-HER2組β-catenin蛋白表達明顯低于對照組和NC組（0.687±0.059），（0.651±0.052）比（0.092±0.011），

F

=158.849，

P

＜0.05］。

圖4 HER2對NK92細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

3 討論

NK細胞是固有免疫系統(tǒng)的主要細胞之一，可識別和殺傷腫瘤細胞，在腫瘤的免疫監(jiān)視中起重要作用。研究顯示，結(jié)直腸癌腫瘤組織中淋巴細胞大量浸潤的病人預后較好，原因與NK細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷作用密不可分。NK92細胞是一種NK細胞，與人NK細胞具有相似的表面分子特征和功能特點，對血液系統(tǒng)腫瘤、黑素瘤等具有很強的殺傷活性，且不引起自身正常細胞損傷，是目前認為的一種理想的可用于腫瘤生物治療的細胞系。

HER2是一種由原癌基因表達的跨膜糖蛋白，可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和血管生成，抑制腫瘤細胞的凋亡。研究顯示，HER2在結(jié)直腸癌組織中的表達水平明顯高于正常組織，其表達水平與腫瘤浸潤深度密切相關(guān)，可作為判斷結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移的有效生物學指標。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌細胞系中HER2蛋白表達明顯高于正常結(jié)腸細胞，與相關(guān)研究結(jié)果一致，提示HER2參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展；研究顯示，激活HER2-ERK1/2信號轉(zhuǎn)導途徑可促進乳腺癌MCF-7細胞的遷移和侵襲；HER2靶向NK細胞可用于治療HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌。本研究結(jié)果顯示，重組HER2可降低NK92細胞的趨化運動，而抑制HER2表達后NK92細胞趨化運動明顯升高，說明抑制HER2表達可增強結(jié)直腸癌NK92細胞趨化運動。

Wnt/β-catenin是細胞內(nèi)一條重要的信號途徑，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，抑制Wnt/β-catenint通路可降低腫瘤細胞生長、侵襲、遷移。β-catenin是Wnt/β-catenint信號的關(guān)鍵分子，研究顯示，NK細胞對非小細胞肺癌細胞NCI-H292具有殺傷作用，并可抑制β-catenin蛋白表達。本研究結(jié)果顯示，HER2表達受到抑制后，NK92細胞中β-catenin蛋白表達明顯降低，而重組HER2則會促進NK92細胞中β-catenin蛋白表達，提示抑制HER2表達可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路增強結(jié)直腸癌NK細胞的趨化運動，進而增加結(jié)直腸癌NK細胞局部浸潤。

綜上所述，抑制HER2基因表達可增強結(jié)直腸癌NK92細胞局部浸潤，機制與下調(diào)Wnt/β-catenin信號有關(guān)。提示HER2可能是結(jié)直腸癌治療的有效靶點之一。