任繼兵，陳夢琳，李傳斌

結直腸癌（CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，靶向治療可有效改善生存率，降低病死率。研究表明異常表達的長鏈非編碼RNA（lncRNA）影響了CRC的發(fā)生發(fā)展，并作為結直腸癌診斷、治療及預后的靶標。長鏈基因間非編碼RNA 00963（LINC00963）是一種新的長非編碼RNA，敲低LINC00963可減弱C4-2細胞的增殖、侵襲能力，促進細胞凋亡，通過表皮生長因子受體（EGFR）信號通路參與前列腺癌從雄激素依賴向雄激素獨立的轉變。LINC00963在肝癌細胞中上調，其通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）途徑和促進肝細胞癌細胞的增殖能力顯著延長肝細胞癌細胞的G0/G1期。復發(fā)和轉移是導致結直腸癌病人死亡的重要原因，而上皮-間質轉化（EMT）在多種類型腫瘤的原位浸潤和遠處轉移扮演重要角色，研究發(fā)現miRNA可參與調控EMT轉化影響結直腸癌的侵襲及轉移。微小RNA-148b-3p（miR-148b-3p）是miRNA的一種，研究發(fā)現miR-148b-3p在膠質瘤細胞中低表達，過表達抑制膠質瘤增殖和侵襲；此外，微小RNA-148-b（miR-148b）可調節(jié)垂體腺瘤細胞的增殖和侵襲。但LINC00963和miR-148b-3p對結直腸癌細胞增殖、遷移侵襲的影響還尚未可知。本研究旨在研究LINC00963是否通過控miR-148b-3p影響結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究于2018年8月至2019年5月進行。

1 材料與方法

1.1 材料

正常結直黏膜上皮細胞NCM460和結直腸癌細胞株HT29、SW480、SW1116購自中國科學院上海細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibico）；熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司）；Transwell小室、基質膠（美國BD公司）；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Sigma公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）蛋白裂解液（上海碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)正常結直黏膜上皮細胞NCM460和結直腸癌細胞株HT29、SW480、SW1116；取生長至80%融合的HT29細胞，將LINC00963過表達載體陰性對照（pcDNA）、LINC00963過 表 達 載 體（pcDNALINC00963）、LINC00963抑制表達載體陰性對照（si-NC）、LINC00963抑制表達載體（si-LINC00963）、miR-148b-3p模擬物陰性對照（miR-NC）、miR-148b-3p模擬物（miR-148b-3p）轉染至HT29細胞，分別記為pcDNA組、pcDNA-LINC00963組、si-NC組、si-LINC00963組、miR-NC組、miR-148b-3p組；將si-LINC00963分別與miR-148b-3p抑制劑（anti-miR-148b-3p）及陰性對照（anti-miR-NC）共轉染至HT29細胞，記為si-LINC00963+anti-miR-NC組、si-LINC00963+anti-miR-148b-3p組。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2.2 qRT-PCR檢 測miR-148b-3p和LINC00963表達水平提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按試劑盒說明進行PCR，采用2法計算相對表達量。miR-148b-3p引物的正向序列為5′-GGATGTCAGTGCATCACAGAAC-3′，反向序列為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；LINC00963引物的正向序列為5′-GGTAAATCGAGGCCCAGAGAT-3′，反 向 序 列 為5′-ACGTGGATGACAGCGTGTGA-3′；U6引物的正向序列為5′-CGCTTCGGCACATATAC-3′，反向序列為5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物的正向序列為5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，反向序列為5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。

1.2.3 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測蛋白的表達提取細胞總蛋白，定量后進行SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉；加入細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9等一抗在4℃冰箱孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度值。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖各組HT29細胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，按試劑盒說明操作，酶標儀檢測490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲將無血清培養(yǎng)基重懸的細胞接種于Transwell上室，培養(yǎng)24 h，用結晶紫染色細胞，顯微鏡下隨機選取5個計數，取均值。侵襲實驗：用基質膠覆蓋Transwell上室，其余同遷移操作。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗將LINC00963野生型報告質粒（WT-LINC00963）和突變型報告質粒（MUTLINC00963）分別miR-NC和miR-148b-3p與轉染至HT29細胞，按試劑盒說明操作，檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 結直腸癌細胞系中LINC00963和miR-148b-3p的表達

結直腸癌細胞HT29、SW480、SW1116中LINC00963的表達水平高于NCM460細胞，而miR-148b-3p的 表 達 水 平低 于NCM460細 胞（

P

＜0.05），見表1。選擇表達變化最明顯的HT29細胞用作后續(xù)試驗。

表1 LINC00963和miR-148b-3p在結直腸癌細胞中的表達/±s

2.2 LINC00963靶向調控miR-148b-3p的表達

LINC00963與miR-148b-3p有 結 合 位 點（圖1）。miR-148b-3p與WT-LINC00963共轉染的HT29細胞的熒光素酶活性顯著降低（

P

＜0.05）；而miR-148b-3p與MUT-LINC00963共轉染的HT29細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（表2）。pcDNA-LINC00963組miR-148b-3p的表達水平低于pcDNA組；si-LINC00963組miR-148b-3p的表達水平高于si-NC組（

P

＜0.05）（表3）?？梢姡琇INC00963可靶向調控miR-148b-3p的表達。

表2 HT29細胞熒光素酶活性/±s

表3 LINC00963調控miR-148b-3p的表達/±s

圖1 LINC00963與miR-148b-3p的互補核苷酸序列

2.3 干擾LINC00963對HT29細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與si-NC組相比，si-LINC00963組LINC00963表達水平，Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達水平降低，p21表達水平升高，HT29細胞活性及遷移侵襲數量降低（

P

＜0.05）（圖2，表4）。可見，干擾LINC00963表達抑制結直腸癌HT29細胞增殖、遷移和侵襲。

表4 干擾LINC00963對HT29細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

圖2 干擾LINC00963對HT29細胞遷移侵襲和相關蛋白表達的影響：A為Cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白的表達；B為HT29細胞遷移侵襲數（結晶紫染色×200倍）

2.4 miR-148b-3p過表達對結直腸癌HT29細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與miR-NC組相比，miR-148b-3p組miR-148b-3p表達水平升高，Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達水平降低，p21表達水平升高，HT29細胞活性及遷移侵襲數量降低（

P

＜0.05）（圖3，表5）?？梢?，miR-148b-3p過表達抑制結直腸癌HT29細胞增殖、遷移和侵襲。

表5 miR-148b-3p過表達對HT29細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

圖3 Cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達

2.5 抑制miR-148b-3p表達逆轉了干擾LINC00963表達對HT29細胞增殖、遷移和侵襲的作用

與si-LINC00963+anti-miR-NC組相比，si-LINC00963+anti-miR-148b-3p組miR-148b-3p的 表達水平降低，Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達水平升高，p21表達水平降低，HT29細胞活性以及遷移侵襲數量升高（

P

＜0.05）（表6，圖4）。

圖4 Cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白的表達

表6 抑制miR-148b-3p和LINC00963表達對HT29細胞增殖、遷移和侵襲的作/±s

3 討論

目前，結直腸癌的發(fā)病率和死亡率均較高，復發(fā)、轉移和耐藥已成為其臨床治療的主要問題，特異性的靶向藥物可明顯提高腫瘤對藥物的反應率，延長病人的無病生存期和總生存期，改善病人生活質量，延長病人的生存時間。lncRNA影響腫瘤進展，可作為其診斷、治療的靶點。LINC00963在黑色素瘤細胞中上調表達，干擾LINC00963通過miR-608/NACC1途徑可抑制黑色素瘤細胞的增殖，遷移和侵襲。LINC00963表達升高與非小細胞肺癌預后不良相關，可促進體外非小細胞肺癌細胞遷移和侵襲。本研究結果顯示，結直腸癌細胞系HT29、SW480、SW1116中LINC00963表達水平升高，說明LINC00963在結直腸癌細胞中高表達。且本研究還發(fā)現轉染si-LINC00963后，HT29細胞活性降低，遷移和侵襲數量降低；表明干擾LINC00963抑制結直腸癌的增殖、遷移和侵襲。此外，LINC00963還能抑制慢性腎功能衰竭大鼠腎間質纖維化和氧化應激。基質金屬蛋白酶（MMP）中的MMP-2和MMP-9與腫瘤的浸潤和轉移密切相關，且在結直腸癌組織中呈高表達。細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是細胞周期調控蛋白，其低表達會抑制細胞的生長，有研究發(fā)現CyclinD1在結腸癌中過表達，也與結腸癌淋巴結轉移、腫瘤淋巴結遠處轉移（TNM）分期及組織學類型相關。而本研究結果顯示，轉染si-LINC00963后，結直腸癌中Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，表明干擾LINC00963可抑制Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達，進一步證明干擾LINC00963可抑制結直腸癌的增殖、遷移和侵襲。

同樣miRNA作為一類重要的基因表達調控因子，參與癌癥發(fā)生與發(fā)展。有研究報道m(xù)iR-148b-3p可通過直接靶向HOX轉錄物反義RNA（HOTAIR）抑制膠質瘤細胞的惡性生物學行為；miR-148b-3p通過抑制胞質分裂作用因子6（Dock6）/Ras相關的C3肉毒素底物1（Rac1）/細胞分裂周期蛋白42（Cdc42）軸抑制胃癌轉移。miR-148b-3p還可抑制腎癌細胞及胃腸道間質瘤882細胞的增殖和遷移。本研究結果顯示，結直腸癌細胞HT29、SW480、SW1116中miR-148b-3p的表達水平顯著降低，說明miR-148b-3p在結腸癌中低表達。過表達miR-148b-3可降低HT29活性和遷移侵襲數量；說明過表達miR-148b-3可抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，本實驗結果顯示miR-148b-3p受LINC00963的靶向調控，抑制miR-148b-3p表達能逆轉干擾LINC00963對HT29細胞的作用。提示，LINC00963影響HT29細胞增殖、遷移和侵襲機制或與miR-148b-3p相關。

綜上所述，干擾LINC00963可通過調控miR-148b-3p抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。