張海生，黃河，徐震

非小細胞肺癌（NSCLC）是肺部惡性腫瘤，占全部肺癌的80%～85%，大多數(shù)病人確診時已是晚期且出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，手術(shù)無法根治，分子靶向藥物因其靶向、安全、方便等優(yōu)點成為研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（miRNA）參與肺癌細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等過程，可作為肺癌的潛在分子靶標(biāo)及預(yù)后生物標(biāo)志物。研究報道微小RNA-203a-3p（miR-203a-3p）通過抑制LIM和SH3蛋白1（LASP1）抑制鼻咽癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移；miR-203a-3p還抑制肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。miR-203a-3p與NSCLC的放療敏感性相關(guān)，但對NSCLC遷移和侵襲的影響尚不清楚。Mink相關(guān)肽1（KCNE2或MiRP1）屬于KCNE基因家族，作為輔助性β亞基，其產(chǎn)物與離子通道的α亞單位相互作用，發(fā)揮不同生理效應(yīng)，其異常變化可導(dǎo)致梗死后心律失常。有研究發(fā)現(xiàn)KCNE2在胃癌組織和細胞中下調(diào)表達，KCNE2表達的喪失有助于胃腫瘤的侵襲性生長。然而KCNE2在NSCLC的表達及其是否影響NSCLC的增殖、遷移和侵襲也尚不清楚。本研究主要研究miR-203a-3p是否通過KCNE2影響NSCLC的增殖、遷移和侵襲。

1 資料與方法

1.1 一般資料

正常肺上皮細胞BEAS-2B和肺癌細胞H1299、SPC-A-1、NC-H446購自中國科學(xué)院上海細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibico）；熒光定量試劑盒（日本TaKaRa）；MTT試劑盒（日本同仁研究所）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天）；Transwell小室、基質(zhì)膠（美國Corning）；兔抗人KCNE1多克隆抗體、兔抗人細胞周期素依賴蛋白激酶6（CDK6）多克隆抗體、兔抗人細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）多克隆抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）多克隆抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體、山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）購自北京博奧森生物科技有限公司。本研究于2018年7月至2019年6月進行。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組正常肺上皮細胞BEAS-2B和肺癌細胞H1299、SPC-A-1、NC-H446用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；取肺癌細胞SPC-A-1，將miR-203a-3p模擬物（miR-203a-3p mimics）及陰性對照（miR-con）、KCNE2干擾表達載體（si-KCNE2）及陰性對照（sicon）轉(zhuǎn)染至SPC-A-1，記為miR-con組、miR-203a-3p、si-con組、si-KCNE2組；將miR-203a-3p模擬物分別與KCNE2過表達載體（pcDNA-KCNE2）及陰性對照（pcDNA）共 轉(zhuǎn) 染 至SPC-A-1，記 為miR-203a-3p+pcDNA-KCNE2組、miR-203a-3p+pcDNA組。正常培養(yǎng)的SPC-A-1細胞作為對照（NC）組。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2.2 qRT-PCR檢 測miR-203a-3p和KCNE2 mRNA表達水平提取各組細胞總RNA，合成cDNA后按試劑盒說明進行PCR，用2法計算相對表達量。

1.2.3 Western blotting檢測蛋白表達提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入相應(yīng)的KCNE2、Cyclin D1、CDK6、MMP-9、MMP-2、β-actin等一抗4℃孵育過夜，然后加入山羊抗兔IgG-HRP二抗室溫孵育2 h，顯影，成像，分析蛋白條帶吸光度值，以β-actin為內(nèi)參。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖細胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時，按試劑盒說明操作，檢測490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲取200 μL無血清重懸的細胞懸液接種于Transwell小室上室，培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定細胞，然后用0.1%結(jié)晶紫染色，洗滌、干燥后在顯微鏡下觀察并計算遷移細胞數(shù)。將稀釋好的基質(zhì)膠鋪于Transwell上室，后按遷移實驗操作。

1.2.6 熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-203a-3p對KCNE2的靶向調(diào)控將KCNE2野生型熒光素酶報告載體（KCNE2-WT）和突變型熒光素酶報告載體（KCNE2-MUT）分別與miR-con和miR-203a-3p共轉(zhuǎn)染至細胞SPC-A-1，按說明書要求檢測細胞熒素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 肺癌細胞系中miR-203a-3p和KCNE2的表達

人肺癌細胞H1299、SPC-A-1、NC-H446中miR-203a-3p的表達水平顯著低于BEAS-2B細胞，而KCNE2 mRNA和蛋白的表達水平顯著高于BEAS-2B細胞（

P

＜0.05）（圖1，表1）?？梢姡伟┘毎抵蠯CNE2高表達，miR-203a-3p低表達。

圖1 檢測肺癌細胞系中Mink相關(guān)肽1的表達

表1 肺癌細胞系中miR-203a-3p和KCNE2的表達/xˉ±s

2.2 miR-203a-3p對細胞SPC-A-1增殖的影響

與miR-con組 相 比，miR-203a-3p組miR-203a-3p表達水平顯著升高，Cyclin D1、CDK6表達水平以及SPC-A-1細胞的活性顯著降低（

P

＜0.05）。可見，miR-203a-3p過表達抑制肺癌細胞SPC-A-1增殖。見圖2，表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-203a-3p對肺癌細胞SPC-A-1增殖的影響/xˉ±s

圖2 檢測肺癌細胞SPC-A-1中CDK6和Cyclin D1蛋白的表達

2.3 miR-203a-3p對SPC-A-1細胞遷移侵襲的影響

miR-203a-3p組SPC-A-1細胞的遷移、侵襲數(shù)以及MMP-2、MMP-9表達水平顯著低于miR-con組（

P

＜0.05），miR-203a-3p過表達抑制肺癌細胞SPC-A-1遷移和侵襲。見圖3，4；表3。

表3 miR-203a-3p對SPC-A-1細胞遷移侵襲的影響/xˉ±s

圖3 檢測細胞SPC-A-1遷移侵襲數(shù)（結(jié)晶紫染色×200）

2.4 miR-203a-3p靶向調(diào)控KCNE2的表達

KCNE2與miR-203a-3p有靶向結(jié)合位點（圖5A）。miR-203a-3p與KCNE2-WT共轉(zhuǎn)染后的SPC-A-1細胞熒光素酶 活 性 顯 著 降 低（

P

＜0.05）；而miR-203a-3p與KCNE2-MUT共轉(zhuǎn)染后的SPC-A-1細胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表4）。anti-miR-203a-3p組KCNE2的表達水平高于anti-miR-con組，（0.83±0.08）比（0.54±0.05）；而miR-203a-3p組KCNE2表達水平低于miR-con組（0.18±0.04）比（0.59±0.06）（

P

＜0.05）（圖5B）。

表4 雙熒光素酶報告實驗/xˉ±s

圖5 miR-203a-3p與KCNE2互補的核苷酸序列：A為KCNE2與miR-203a-3p有靶向結(jié)合位點；B為KCNE2蛋白表達

2.5 沉默KCNE2對肺癌細胞SPC-A-1增殖、遷移、侵襲的影響

與si-con組相比，si-KCNE2組KCNE2、Cyclin D1、CDK6、MMP-2、MMP-9表達水平降低，SPC-A-1細胞活性及遷移侵襲數(shù)顯著降低（

P

＜0.05），沉默KCNE2抑制肺癌細胞SPC-A-1增殖、遷移和侵襲。見圖6，表5。

表5 沉默KCNE2表達對肺癌細胞SPC-A-1增殖、遷移、侵襲的影響/xˉ±s

圖6 檢測肺癌細胞SPC-A-1中CDK6、Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達

圖4 檢測細胞SPC-A-1中MMP-2、MMP-9蛋白的表達

2.6 同時過表達KCNE2和miR-203a-3p對細胞SPC-A-1增殖、遷移、侵襲的作用

與miR-con組相比，miR-203a-3p組肺癌細胞SPC-A-1中KCNE2、Cyclin D1、CDK6、MMP-2、MMP-9表達水平降低，SPCA-1細胞活性及遷移侵襲數(shù)降低（

P

＜0.05）；與miR-203a-3p+pcDNA組相比，miR-203a-3p+pcDNA-KC-NE2組 肺 癌 細 胞SPC-A-1中KCNE2、Cyclin D1、CDK6、MMP-2、MMP-9表達水平升高，SPC-A-1細胞活性及遷移侵襲數(shù)升高（

P

＜0.05），見表6、圖7。

圖7 檢測肺癌細胞SPC-A-1中CDK6、Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達

表6 同時過表達KCNE2和miR-203a-3p對細胞SPC-A-1增殖、遷移、侵襲的作用/xˉ±s

3 討論

NSCLC是發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命健康。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中具有重要作用。miR-203a-3p作為腫瘤抑制因子可抑制胃癌細胞增殖。過表達miR-203a-3p還可抑制卵巢癌及結(jié)腸直腸癌的增殖和遷移；還可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞間充質(zhì)-上皮細胞轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，肺癌細胞系中miR-203a-3p下調(diào)表達，過表達miR-203a-3p可抑制SPC-A-1細胞增殖、遷移和侵襲。細胞周期素D1（Cyclin D1）和細胞周期素依賴蛋白激酶6（CDK6）是細胞周期調(diào)控的主要因子，抑制CDK6可將細胞周期阻滯于G1期，而抑制Cyclin D1可抑制細胞周期從S期向G1期轉(zhuǎn)換。MMP-2和MMP-9同屬基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族，與細胞侵襲性相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)增加MMP-2和MMP-9的表達促進肺癌細胞的侵襲。本研究過表達miR-203a-3p后抑制了Cyclin D1、CDK6、MMP-2、MMP-9蛋白的表達，進一步說明miR-203a-3p可抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

KCNE2是編碼鉀離子通道亞基的基因，KCNE2在胃癌細胞中下調(diào)表達，過表達抑制SGC7901細胞的生長和細胞周期的進展。miR-584-5p通過靶向KCNE2調(diào)節(jié)肝細胞癌細胞的遷移和侵襲。KCNE2在缺血心肌中表達增高，與急性心肌梗死相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，KCNE2在肺癌細胞中高表達，沉默KCNE2可抑制SPC-A-1增殖、遷移和侵襲。此外，miR-203a-3p靶向調(diào)控KCNE2，而KCNE2過表達部分逆轉(zhuǎn)了miR-203a-3p對SPC-A-1細胞的作用。提示，miR-203a-3p可能通過調(diào)控KCNE2影響肺癌細胞進展。

綜上所述，過表達miR-203a-3p可通過下調(diào)KCNE可抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。