陳朝琴,薛治乾,李文霞
甲狀腺癌是頭頸部腫瘤及內分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,女性發(fā)病率高于男性。甲狀腺癌的發(fā)病率在全球范圍內呈現(xiàn)持續(xù)快速增長趨勢。近些年來,分子靶向治療腫瘤成為研究熱點。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度大于200 nt的非編碼RNA,在多種腫瘤中以原癌基因或抑癌基因形式存在,參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展。lncRNA核仁小RNA宿主基因15(SNHG15)定位于7p13染色體上,與乳腺癌、胰腺癌、骨肉瘤等多種腫瘤細胞生長有關。研究顯示,lncRNA SNHG15在甲狀腺癌細胞中表達升高,抑制lncRNA SNHG15表達可降低細胞增殖能力,并誘導細胞凋亡,但其對甲狀腺癌細胞侵襲、凋亡的分子機制尚未明確。生物信息學預測顯示,miR-141是lncRNA SNHG15的靶基因。本研究起止時間為2018年10月至2019年5月,以甲狀腺癌FRO細胞為研究對象,旨在探討lncRNA SNHG15是否通過調控miR-141表達影響甲狀腺癌細胞的侵襲和凋亡。
1.1 試劑和儀器
人甲狀腺癌FRO細胞購自美國ATCC。DMEM培養(yǎng)基、FBS均購自美國Gibco公司;實時熒光定量PCR試劑盒及反轉錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司;SNHG15小干擾RNA(si-SNHG15)、miR-141抑制劑inhibitor(anti-miR-141)及miR-141模擬物(mimics)均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成;Transwell小室購自美國corning公司;細胞凋亡試劑盒及流式細胞儀均購自美國BD公司;鼠抗人上皮鈣黏素(E-cadherin)單抗、鼠抗人B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)單抗、鼠抗人Bcl-2相關X蛋白(Bax)單抗及HRP標記的二抗均購自美國CST;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。1.2 細胞培養(yǎng)
FRO細胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,于5%體積分數(shù)二氧化碳、飽和濕度及37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。選擇生長至對數(shù)期的細胞進行試驗研究。1.3 轉染
待FRO細胞生長至對數(shù)期后,以3×10個/孔接種于6孔板中,37℃培養(yǎng)箱過夜,使轉染時細胞達到70%~80%的生長融合度。參照Lipofectamine 2000試劑盒(美國Invitrogen)說明,將SNHG15小干擾RNA(siRNA)、siRNA陰性對照(siRNA control)、miR-141抑制劑(miR-141 inhibitor)或抑制劑陰性對照(inhibitor control)轉染至甲狀腺癌FRO細胞,細胞隨機分組空白對照(si-control)組、轉染陰性對照(si-NC)組、轉染SNHG15 siRNA(si-SNHG15)組、轉染SNHG15 siRNA和inhibitor control(si-SNHG15+anti-control)組和轉染SNHG15 siRNA和miR-141 inhibitor(si-SNHG15+anti-miR-141)組。轉染48 h,收集細胞用于后續(xù)研究。1.4 qRT-PCR實驗
提取細胞總RNA,并逆轉錄合成為cDNA。以cDNA為模板,參照PCR試劑盒設置反應條件,反應體系為20 μL,采用實時熒光定量PCR儀 進 行擴增。SNHG15:正向引物5′-CAACCATAGCGGTGCAAC TGTGC-3′,反 向 引 物3′-GGCTGAACCAAGTTGCAAGTC ATG-5′。SNHG15內參GAPDH:正向引物5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTAT-3′,反向引物:3′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-5′。miR-141:正向引物5′-GGGCATCTTCCAGTACAGT-3′,反向引物3′-CAGTGCGTGTCG TGGAGT-5′。miR-141內參U6:正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,反向引物3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′。以檢測所得到的Ct均值,采用2方法計算SNHG15和miR-141的相對表達量。每組設置6個復孔,實驗重復3次。
1.5 細胞侵襲能力檢測
采用Transwell實驗檢測甲狀腺癌細胞的侵襲能力。Transwell小室上室接種5×10個含無血清培養(yǎng)基的細胞,下室裝含有10% FBS的培養(yǎng)基。37℃條件下孵育細胞48 h,甲醇固定,結晶紫染色,棉簽輕輕擦除小室內基底膜的細胞。顯微鏡下每膜隨機選擇5個視野,計數(shù)穿膜細胞數(shù)。取均值,實驗重復3次。1.6 細胞凋亡檢測
收集轉染后的細胞,制備成單細胞懸液,并將細胞濃度調整為5×10個/毫升。取1 mL細胞,離心,棄掉上清,預冷的PBS洗滌細胞,離心,棄掉上清,加200 μL的結合緩沖液重懸細胞,然后再加入Annexin V-FITC和PI各5 μL,輕柔混勻,室溫條件下避光反應15 min,1 h內,通過流式細胞儀檢測。實驗重復3次,取均值,計算細胞的凋亡率。1.7 熒光素酶報告實驗
Diana Tools、Starbase和TargetScan靶基因軟件顯示SNHG15與miR-141有可結合的位點,構建野生型(WT)及突變型(MUT)SNHG15載體,與miR-141 mimics共轉染進FRO細胞。按照熒光素酶活性檢測試劑盒說明檢測FRO細胞熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海參熒光素酶活性值。1.8 蛋白表達檢測
細胞中加入適量蛋白裂解液提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。蛋白于100℃變性5 min,每孔道上樣30 μg變性蛋白,12% SDS-PAGE分離蛋白,常規(guī)濕法轉膜,然后加5%脫脂奶粉封閉膜2 h,洗膜,加E-cadherin、Bcl-2、Bax及內參GAPDH一抗(1∶500),4℃孵育過夜,洗膜,加二抗(HRP標記的羊抗鼠),37℃搖床震蕩封閉1 h,加入ECL液,凝膠成像系統(tǒng)曝光,Quantity One軟件對蛋白印跡條帶定量。以檢測的目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值比值為各蛋白的相對表達量。實驗重復3次。2.1 抑制SNHG15表達對FRO細胞侵襲能力的影響
qRT-PCR結果顯示,si-SNHG15轉染FRO細胞48 h,SNHG15 mRNA表達明顯低于si-control組(P
<0.05),而si-NC組SNHG15 mRNA表達與si-control組差異無統(tǒng)計學意義(P
>0.05)。Transwell小室檢測細胞侵襲結果顯示,與si-control組比較,si-SNHG15組細胞侵襲能力明顯降低(P
<0.05)。見表1。表1 抑制SNHG15表達后FRO細胞SNHG15 mRNA表達及侵襲細胞數(shù)/±s
2.2 抑制SNHG15表達對FRO細胞凋亡的影響
Annexin V-FITC/PI雙染后流式細胞儀檢測結果顯示,與si-control組(4.31±0.42)%和si-NC組(4.68±0.53)%比較,si-SNHG15組FRO細胞凋亡率(33.11±1.69)%明顯升高(P
<0.05)。見圖1。圖1 抑制SNHG15表達后FRO細胞凋亡圖
2.3 靶向關系驗證
經生物信息學分析發(fā)現(xiàn),SNHG15和miR-141存在可結合的位點(圖2)。將SNHG15野生型(SNHG15-WT)及SNHG15突變型(SNHG15-MUT)分別與miR-141mimics共轉染FRO細胞,雙熒光素酶報告實驗顯示,SNHG15-WT與miR-141mimics共轉染FRO細胞后,熒光素酶活性明顯降低(P
<0.05),而SNHG15-MUT與miR-141mimics共轉染FRO細胞后,熒光素酶活性無明顯變化(P>
0.05)(表2),說明SNHG15與miR-141存在靶向關系。qRTPCR結果顯示,與si-control組(1.000)相比,si-SNHG15組細胞中miR-141 mRNA表達(3.012±0.187)明顯升高(P
<0.05),而 與si-SNHG15+anti-control組(3.045±0.172)相比,si-SNHG15+anti-miR-141組相比中miR-141 mRNA表達(1.413±0.067)明顯降低(P
<0.05)。說明SNHG15靶向負調控miR-141表達。圖2 生物信息學預測SNHG15和miR-141的結合位點
表2 熒光素酶活性檢測結果/±s
2.4 抑制miR-141表達可減弱SNHG15對FRO細胞侵襲和凋亡的影響
如表3所示,si-SNHG15轉染FRO細胞后,與si-control組比較,si-SNHG15組細胞侵襲能力明顯降低,凋亡率升高(P
<0.05),而將si-SNHG15與anti-miR-141共同 轉染FRO細 胞 后,與si-SNHG15+anti-control組比較,細胞侵襲能力明顯升高,凋亡率降低(P
<0.05)。表3 SNHG15靶向miR-141對FRO細胞侵襲和凋亡影響/±s
2.5 抑制miR-141表達可減弱SNHG15對FRO細胞E-cadherin、Bcl-2和Bax表達的影響
Western blotting檢測抑制SNHG15或共同抑制SNHG15和miR-141表達后FRO細胞侵襲相關的E-cadherin及與凋亡相關的Bcl-2和Bax表達,結果如圖3和表4所示,與si-control組比較,si-SNHG15組E-cadherin和Bax表達明顯升高,Bcl-2表達明顯降低(P
<0.05),將si-SNHG15與anti-miR-141共同轉染FRO細胞后,與si-SNHG15+anti-control組比較,E-cadherin和Bax表達明顯降低,Bcl-2表達明顯升高(P
<0.05)。表4 SNHG15靶向miR-141對FRO細胞E-cadherin、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響/±s
圖3 FRO細胞E-cadherin、Bcl-2和Bax蛋白表達條帶
作為一種新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA類,lncRNA在人類疾病診斷及腫瘤治療中應用廣泛。lncRNA可通過多種分子機制及途徑對基因表達進行調解,進而影響多種生物學功能,其表達及調控異常與多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關。目前大量研究表明lncRNA可作為腫瘤診療的一種生物標志物。因此,研究lncRNA在甲狀腺癌中的作用對于其治療尤為重要。有研究顯示,肝癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG15表達高于臨近非腫瘤組織,其表達與組織學分級、TNM分期及靜脈侵襲有關;lncRNA SNHG15可通過調節(jié)miR-153影響膠質瘤微血管內皮細胞的生長;上調lncRNA SNHG15表達可通過調控基質金屬蛋白酶2(MMP2)/基質金屬蛋白酶9(MMP9)促進胃癌細胞侵襲和遷移。但lncRNA SNHG15對甲狀腺癌的影響還未知。本研究將SNHG15特異性siRNA轉染甲狀腺癌FRO細胞,SNHG15表達明顯降低,細胞侵襲能力降低,凋亡率升高,提示抑制SNHG15表達可明顯降低甲狀腺癌細胞生長。
微小RNA(microRNA或miRNA)是一類非編碼小分子RNA,長度約為18~22 nt,可在轉錄后水平調節(jié)基因表達,miR-141是微小RNA家族中的一員,與結直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞生長有關。研究顯示,甲狀腺癌中miR-141表達降低,miR-141可通過靶向胰島素受體底物2抑制甲狀腺癌細胞生長和轉移。生物信息學顯示SNHG15與miR-141有可結合位點,本研究通過熒光素酶報告實驗進一步證實SNHG15靶向負調控miR-141表達。細胞侵襲及凋亡實驗表明,抑制SNHG15與miR-141表達可減弱抑制SNHG15對甲狀腺癌細胞侵襲和凋亡的影響,說明SNHG15可調控miR-141影響甲狀腺癌細胞侵襲和凋亡。
腫瘤侵襲遷移是一個復雜的過程,EMT是影響腫瘤侵襲轉移的一個關鍵步驟,而E-cadherin的減少或丟失是EMT形成的一個最重要標志。有研究顯示,BCORL1可通過下調E-cadherin促進甲狀腺癌細胞侵襲轉移;Dickkopf-1(DKK-1)可通過抑制β-catenin/E-cadherin促進甲狀腺癌細胞存活和遷移。本研究結果顯示,抑制SNHG15表達可上調E-cadherin表達,而同時抑制SNHG15和miR-141表達可降低E-cadherin表達,提示SNHG15調控miR-141對甲狀腺癌侵襲影響與調節(jié)E-cadherin表達有關。誘導細胞凋亡是腫瘤治療的主要機制。Bcl-2和Bax均為Bcl-2家族成員,發(fā)揮抑凋亡和促凋亡作用,Bcl-2/Bax比率是啟動細胞凋亡的“分子開關”,是目前研究較多的與腫瘤凋亡相關的兩個基因。多項研究表明,對Bcl-2和Bax表達調節(jié)可影響腫瘤細胞凋亡。本研究結果顯示,抑制SNHG15表達可上調Bax表達,下調Bcl-2表達,而同時抑制SNHG15和miR-141表達可下調Bax表達,上調Bcl-2表達,提示SNHG15調控miR-141對甲狀腺癌細胞凋亡影響與調節(jié)Bcl-2和Bax表達有關。
綜上所述,SNHG15可靶向調節(jié)miR-141表達,降低甲狀腺癌細胞侵襲能力,誘導細胞凋亡,機制與調節(jié)E-cadherin、Bcl-2和Bax表達有關。本研究可能為甲狀腺癌的診療提供理論依據(jù),但仍需更深入的探究。