矯璐宇，秦春新，楊小青，于浩，王子良

乳腺癌是女性疾病中常見惡性腫瘤之一，隨著 現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快及生活壓力的增大導致乳腺癌呈年輕化發(fā)展趨勢。研究表明乳腺癌發(fā)病機制與細胞周期異常、細胞惡性增殖等密切相關。細胞分裂周期相關蛋白2（CDCA2）可調控細胞周期進程，研究報道指出CDCA2在胰腺導管腺癌組織中表達水平明顯升高，敲低CDCA2表達可抑制胰腺癌細胞增殖能力。CDCA2在肺腺癌組織中高表達，其表達量升高可作為肺腺癌患者預后不良的獨立預測因子，進一步研究發(fā)現(xiàn)抑制CDCA2表達可通過下調細胞周期蛋白E1（CCNE1）而抑制肺腺癌細胞的增殖，而過表達CDCA2通過上調CCNE1促進肺腺癌細胞增殖。但CDCA2在乳腺癌致病機制中的研究尚未見相關報道。慢病毒siRNA干擾具有持續(xù)時間長、穩(wěn)定性高等優(yōu)點的敲除工具。本研究自2019年2—7月通過慢病毒介導的RNAi技術沉默乳腺癌細胞中CDCA2基因表達，觀察其對細胞增殖、凋亡及克隆能力的影響，探討其在乳腺癌治療及預防乳腺癌的潛在應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常乳腺上皮細胞株MCF-10A購自上海昱都生物科技有限公司；乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549購自上?；鄯f生物科技有限公司；高度免疫缺陷雄性小鼠（20只），體質量范圍為20～30 g，購自北京維通達生物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2017-0008。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學相關標準。慢病毒LV3-shCDCA2、LV3-shNC均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；細胞凋亡試劑盒購自美國Beckman公司；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒均購自日本TaKaRa公司；鼠抗人細胞周期素D1（Cyclin D1）、CDK4、P21、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X（Bax）多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔抗人CDCA2單抗購自上海玉博生物科技有限公司（NeoMarkers品牌代理）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；MTT購自上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及慢病毒感染乳腺癌MCF-7細胞人正常乳腺上皮細胞株MCF-10A、乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、BT549細胞置于含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，放入37℃、5%二氧化碳體積分數(shù)、相對濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞以1∶2比例進行傳代，待細胞穩(wěn)定傳代2～3代后，收集對數(shù)生長期乳腺癌MCF-7細胞，慢病毒LV3-shNC是不含目的基因的真核表達載體，慢病毒LV3-shCDCA2是含有CDCA2特異性siRNA表達載體。采用病毒介導法分別將LV3-shNC、LV3-shCDCA2轉染乳腺癌MCF-7細胞，應用已確定篩選濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)液進行抗性篩選，每隔2 d更換一次培養(yǎng)液，實時觀察細胞生長狀況，培養(yǎng)14 d后選取抗性克隆團進行后續(xù)實驗，進一步擴大培養(yǎng)后，抗性克隆形成7 d后，收集抗性克隆細胞，實驗將其分為對照組（空白組）、Lv-NC組（陰性對照組）、Lv-siRNA-CDCA2組（干擾組）。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中CDCA2 mRNA表達水平采用Trizol法提取各組細胞總RNA，應用反轉錄試劑盒合成cDNA，反應條件為42℃30 min，95℃變性5 min，4℃退火5 min，cDNA進行qRT-PCR，反應條件為95℃預變性5 min循環(huán)1次，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次，實驗結果采用2法進行計算，即2，每組均設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 噻唑藍（MTT）檢測細胞增殖分別收集各組乳腺癌MCF-7細胞，以每孔5×10個細胞的密度將細胞接種于96孔板，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h時每孔分別加入20 μL質量分數(shù)為5 mg/mL的MTT，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔各加入150 μL DMSO，充分溶解后，振蕩10 min，選擇490 nm波長在酶標儀上檢測各孔光密度值（OD）。

1.2.4 平板克隆形成實驗收集對數(shù)生長期各組乳腺癌MCF-7細胞，使用0.25%胰酶消化細胞制備單細胞懸液，采用臺酚藍計數(shù)細胞，按照每孔300個細胞的密度將細胞接種于6孔板，每組細胞均設置3個復孔，按照“十”字方向晃動培養(yǎng)板促使細胞均勻分散，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)14 d，每天需將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察細胞克隆形成情況，若培養(yǎng)板上出現(xiàn)肉眼可見克隆需終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，使用預冷PBS洗滌2次，加入甲醇3 mL固定15 min，棄固定液，加入吉姆薩染液2 mL染色30 min，沖洗染色液，干燥，置于顯微鏡下觀察克隆大小，將超過50個細胞團進行計數(shù)，克隆形成率（%）=（平均克隆數(shù)/每孔接種細胞數(shù)）×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡分別收集各組乳腺癌MCF-7細胞，以每孔5×10個細胞的密度將細胞接種于6孔板，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，參照Annexin V-FITC/PI上染細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測CDCA2、Cyclin D1、CDK4、P21、Bcl-2、Bax蛋白表達采用預冷RIPA裂解液處理各組細胞，應用超聲破碎儀破碎細胞，4℃，12 000 r/min轉速10 min（離心半徑6cm），提取細胞總蛋白，采用BCA法定量蛋白，取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳反應，轉膜，室溫條件下采用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入稀釋后的一抗（稀釋比1∶1 000）4℃過夜，TBST清洗，室溫條件下加入稀釋后的二抗（稀釋比1∶5 000），ECL顯影，置于自動凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

1.2.7 裸鼠移植瘤實驗LV3-shNC、LV3-shCDCA2轉染乳腺癌MCF-7細胞，轉染24 h后棄舊培養(yǎng)基，PBS洗滌，胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液（1×10個/100 μL），4℃條件下，轉速1 000 r/min離心5 min，預冷PBS洗滌，1 mL注射器吸取100 μL細胞懸液注射入小鼠右側腋窩皮下，觀察并記錄裸鼠生長及移植瘤成長狀況，每周分別檢測腫瘤體積，第5周時使用脫頸法處死裸鼠，剝離腫瘤組織并進行稱重。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞中CDCA2表達水平

qRT-PCR與Western blotting實驗結果顯示，與MCF-10A相比，乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549中CDCA2 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高（

P

＜0.05），其中乳腺癌MCF-7細胞中CDCA2的表達水平升高最為顯著，因此選取乳腺癌MCF-7細胞進行后續(xù)研究，見圖1，表1。

圖1 乳腺癌細胞中CDCA2蛋白表達條帶

表1 乳腺癌細胞中CDCA2表達/±s

2.2 重組慢病毒siRNA CDCA2感染MCF-7細胞后CDCA2表達水平

qRT-PCR與Western blotting法驗證重組慢病毒介導CDCA2基因沉默效果，結果顯示，與Lv-NC組相比，Lv-siRNA-CDCA2組乳腺癌MCF-7細胞中CDCA2 mRNA及蛋白表達水平均顯著降低（

P

＜0.05），而對照組與Lv-NC組相比差異無統(tǒng)計學意義（

P＞

0.05），見圖2，表2。

圖2 各組MCF-7細胞中CDCA2蛋白表達條帶

表2 MCF-7細胞中CDCA2表達/±s

2.3 沉默CDCA2對MCF-7細胞增殖的影響

MTT實驗檢測沉默CDCA2對MCF-7細胞增殖的影響，結果顯示，相對于Lv-NC組，Lv-siRNA-CDCA2組乳腺癌MCF-7細胞增殖活性顯著降低（

P

＜0.05），Western blotting實驗 結 果顯示Lv-siRNA-CDCA2組乳腺癌MCF-7細胞中Cyclin D1、CDK4蛋白水平顯著低于Lv-NC組（

P

＜0.05），而P21蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05），見圖3，表3。

表3 沉默CDCA2對MCF-7細胞增殖的影響/±s

圖3 各組乳腺癌細胞MCF-7細胞增殖相關蛋白表達條帶

2.4 沉默CDCA2對MCF-7細胞克隆形成能力的影響

克隆形成實驗結果對照組、Lv-NC組、Lv-siRNA-CDCA2組克隆形成率分別為（46.31±5.98）%、（43.27±5.81）%、（12.34±1.25）%，相對于Lv-NC組，Lv-siRNA-CDCA2組乳腺癌MCF-7細胞克隆形成率顯著降低（

F

=134.209，

P

＜0.05）。

2.5 CDCA2基因對裸鼠移植瘤生長的影響

裸鼠移植瘤實驗結果顯示，與Lv-NC組比較，Lv-siRNA-CDCA2組移植瘤體積和體質量均顯著降低（

P

＜0.05）；對照組體積、體質量比較差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。見圖4。

圖4 各組裸鼠腫瘤生長

2.6 沉默CDCA2對MCF-7細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測沉默CDCA2對MCF-7細胞凋亡的影響，結果顯示，Lv-siRNA-CDCA2組細胞凋亡率顯著升高（

P

＜0.05），Western blotting實驗結果顯示，LvsiRNA-CDCA2組乳腺癌MCF-7細胞Bcl-2蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05），而Bax蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05），見圖5，表4。

圖5 沉默CDCA2對MCF-7細胞凋亡的影響：A為各組MCF-7細胞流式凋亡圖；B為各組MCF-7細胞凋亡相關蛋白表達條帶

表4 沉默CDCA2對MCF-7細胞凋亡的影響/±s

3 討論

乳腺癌細胞增殖與凋亡失衡及細胞遷移、侵襲能力增強可促進該疾病發(fā)生及發(fā)展，但關于其具體作用機制尚未完全闡明。因而深入探究基因通過哪種途徑促進乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲有助于揭示乳腺癌致病機制。研究表明抑制Jab1表達可抑制乳腺癌細胞增殖及遷移。慢病毒介導的SGK3基因沉默可影響乳腺癌細胞增殖及凋亡等生物學過程。相關研究報道指出慢病毒介導MRPS23基因沉默可促進乳腺癌細胞凋亡。因此，本研究積極探尋新型基因與乳腺癌細胞增殖及凋亡等生物學行為的關系，為揭示乳腺癌致病機制提供新方向。

CDCA2基因可通過調控蛋白磷酸酶1γ依賴的DNA損傷進而調控細胞周期進程，研究表明CDCA2基因在多種惡性腫瘤中均呈高表達，其高表達量與患者臨床病理分期及其相關臨床病理特征密切相關，沉默CDCA2基因表達可誘導細胞周期阻滯，并可抑制腫瘤細胞增殖并促進細胞凋亡。研究表明CDCA2基因在卵巢上皮癌中的表達水平明顯增高，其可通過促進細胞增殖及抑制細胞凋亡發(fā)揮促癌基因功能。本研究結果表明CDCA2基因在乳腺癌細胞中的表達水平明顯升高，通過慢病毒介導沉默CDCA2基因表達后，乳腺癌細胞中CDCA2基因表達水平顯著降低，進一步研究顯示沉默CDCA2基因表達后乳腺癌細胞增殖能力明顯降低，Cyclin D1、CDK4蛋白水平明顯降低，而P21蛋白水平明顯升高，已有研究報道指出Cyclin D1與CDK4形成Cyclin-CDK復合物進而正向調控細胞周期進程，促進細胞增殖，P21在多種惡性腫瘤中均呈低表達，并可抑制細胞周期依賴性激酶活性而抑制Cyclin-CDK復合物形成進而抑制腫瘤細胞增殖，且具有抑癌作用。提示沉默CDCA2基因表達可通過促進P21表達及抑制Cyclin D1、CDK4表達進而抑制乳腺癌細胞增殖。Bcl-2屬于原癌基因并可抑制細胞凋亡，Bax是促凋亡基因并可促進細胞凋亡。本研究結果表明沉默CDCA2基因表達可促進乳腺癌細胞凋亡，Bax表達上調，而Bcl-2表達下調，說明沉默CDCA2基因可通過激活細胞凋亡基因Bax表達而抑制原癌基因Bcl-2表達。提示沉默CDCA2基因誘導乳腺癌細胞凋亡可能是通過調控細胞凋亡基因表達而發(fā)揮作用。同時本研究通過裸鼠移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)沉默CDCA2基因可降低移植瘤體質量及減輕移植瘤體積，提示沉默CDCA2基因可抑制乳腺癌生長。

綜上所述，慢病毒介導的RNAi沉默CDCA2基因感染乳腺癌細胞可有效下調CDCA2基因表達，并可通過調控細胞周期及細胞凋亡相關蛋白表達進而抑制乳腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，可為乳腺癌的基因治療提供理論依據(jù)，為揭示乳腺癌致病機制奠定理論基礎。