劉朱美卉，陳曉宇，楊元芳

糖尿病是一系列以血糖水平慢性升高為主要特征的疾病，主要包括1型糖尿病和2型糖尿病。近年來，隨著人們飲食、生活方式等的改變，青年人群中2型糖尿病患病率呈急劇升高趨勢。大量研究表明，長期慢性高血糖刺激可導(dǎo)致進(jìn)行性胰島β細(xì)胞功能障礙，β細(xì)胞凋亡和胰島素分泌減少，從而加重高血糖導(dǎo)致惡性循環(huán)。因此，了解胰島β細(xì)胞糖毒性的確切分子機制對開發(fā)有效的2型糖尿病治療方法具有重要意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類短鏈、內(nèi)源性非編碼RNA，其通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）互補結(jié)合干擾蛋白質(zhì)翻譯和/或促進(jìn)靶mRNA降解，參與包括2型糖尿病在內(nèi)的多種代謝紊亂性疾病進(jìn)展。如2型糖尿病患者中miR-122、miR-7表達(dá)失調(diào)，并對該病具有預(yù)測價值。miR-142-3p可影響胰島β細(xì)胞的生存和功能。有研究指出高糖培養(yǎng)的小鼠原代胰島中miR-320表達(dá)上調(diào)，但miR-320在2型糖尿病中的作用并未完全闡明。本研究在2019年1月至2020年1月開展實驗，通過檢測高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞MIN6中miR-320表達(dá)水平，探討其對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，揭示其潛在作用機制，以為2型糖尿病治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清為美國Gibco公司；miR-320抑制物（anti-miR-320）及其陰性對照（anti-miR-NC）由廣州銳博公司提供；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于北京百奧萊博生物公司；小鼠乳酸脫氫酶酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購于杭州江萊生物；miRNeasy Micro Kit、SYBR Green Mastermix購于北京天根生化科技有限公司；放射免疫沉淀測定（RIPA）緩沖液、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購于上海碧云天生物公司；兔源蛋白激酶B（Protein kinase，Akt）抗體、兔源磷酸化Akt（p-Akt）抗體、兔源磷酸化的哺乳動物雷帕霉素復(fù)合物1（pmTORC1）抗體、AKT/mTOR通路抑制劑（LY294002）購于美國CST公司；兔源剪切型半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)MIN6細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)液（添加10%胎牛血清）在含5%二氧化碳、飽和濕度、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩天換液一次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時進(jìn)行傳代。

1.2.2 實驗分組和細(xì)胞處理將對數(shù)期MIN6細(xì)胞分為對照組、高糖組：采用葡萄糖濃度分別為5.5 mmol/L，25 mmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h；高糖+anti-miR-NC組、高 糖+anti-miR-320組 為 分 別轉(zhuǎn) 染anti-miR-NC、anti-miR-320 48 h后，采用高糖誘導(dǎo)損傷；高糖+LY294002組為培養(yǎng)液中葡萄糖濃度25 mmol/L，LY294002濃度為2 2mg/L；高糖+anti-miR-320+LY294002組為轉(zhuǎn)染anti-miR-320 48 h后，進(jìn)行高糖和LY294002干預(yù)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染嚴(yán)格參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000的說明書進(jìn)行。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖率將MIN6細(xì)胞按照每孔1×10個細(xì)胞密度接種96孔板，細(xì)胞貼壁后按照上述分組進(jìn)行細(xì)胞處理，每孔加入20 μL的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL的二甲基亞砜，低毒振蕩15 min至結(jié)晶溶解。以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度值（A）。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡收集各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞兩次后，采用結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10個/毫升的單細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液加入流式管，分別加入5 μL的Annexin FITC、PI，暗室孵育15 min后，補充結(jié)合緩沖液至500 μL。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 試劑盒測定LDH活力收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清。設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，按照小鼠LDH ELISA檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止反應(yīng)。以空白空調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度，計算LDH活力。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-320表達(dá)采用miRNeasy Micro Kit提取、純化各組細(xì)胞中miRNA，使用Mir逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6為內(nèi)參，利用SYBR Green Mastermix進(jìn)行qPCR。擴增條件如下：變性95℃、15 s，退火60℃、60 s，延伸60℃、60 s，共40個循環(huán)。采用2法檢測miR-320的相對表達(dá)水平。miR-320正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTGAGA-3′，反向引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上 游 引 物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.2.7 Western blotting檢測Caspase-3、Akt、p-Akt和p-mTORC1蛋白表達(dá)使用RIPA緩沖液從各組細(xì)胞樣本中提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白樣品濃度。取等量的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h；加入抗Caspase-3抗體（1∶2 000）、抗p-Akt抗體（1∶2 000）、抗Akt抗體（1∶1 000）、抗p-mTORC1抗體4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育膜1 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑顯色后，以GAPDH為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)分析各目的條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-320在高糖作用的胰島β細(xì)胞中的表達(dá)

與對照組比較，高糖組胰島β細(xì)胞中miR-320的表達(dá)水平顯著升高［（2.69±0.14）比（0.98±0.06），

t

=33.680，

P

＜0.05］。

2.2 干擾miR-320對高糖作用的胰島β細(xì)胞損傷及LDH的影響

與對照組比較，高糖組胰島β細(xì)胞存活率顯著降低，凋亡率顯著升高，Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，LDH活力顯著升高；與高糖+anti-miRNC比較，高糖+anti-miR-320組胰島β細(xì)胞存活率顯著升高，凋亡率顯著降低，Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，LDH活力顯著降低（

P

＜0.05），見表1和圖1。

圖1 干擾miR-320對高糖作用的胰島β細(xì)胞凋亡（A）及Caspase-3蛋白（B）的表達(dá)的影響

表1 干擾miR-320對高糖作用的胰島β細(xì)胞損傷及LDH的影響/±s

2.3 干擾miR-320對高糖作用的胰島β細(xì)胞中Akt/mTOR的影響

與對照組比較，高糖組胰島β細(xì)胞miR-320的表達(dá)水平顯著升高，p-Akt和pmTORC1蛋白表達(dá)顯著降低；與高糖+anti-miR-NC組比較，高糖+anti-miR-320組胰島β細(xì)胞miR-320的表達(dá)水平顯著降低，p-Akt和p-mTORC1蛋白表達(dá)顯著升高（

P

＜0.05），見表2和圖2。

圖2 磷酸化蛋白激酶B、蛋白激酶B、磷酸化的蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素復(fù)合物1蛋白的表達(dá)

表2 干擾miR-320對高糖作用的胰島β細(xì)胞中Akt/mTOR的影響/±s

2.4 Akt3/mTOR信號通路抑制劑對高糖作用的胰島β細(xì)胞損傷及LDH的影響

與高糖組比較，高糖+LY294002組細(xì)胞存活率顯著降低，凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)、LDH活力顯著升高（

P

＜0.05），見表3和圖3。

圖3 Akt3/mTOR信號通路抑制劑對高糖作用的胰島β細(xì)胞凋亡（A）及Caspase-3蛋白表達(dá)（B）的影響

表3 LY294002對高糖作用的胰島β細(xì)胞損傷及LDH的影響/±s

2.5 Akt3/mTOR信號通路抑制劑對干擾miR-320處理的高糖作用的胰島β細(xì)胞損傷及LDH的影響

與高糖+anti-miR-320組比較，高糖+anti-miR-320+LY294002組胰島β細(xì)胞存活率顯著降低，凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)、LDH活力顯著升高（

P

＜0.05）。見表4。

表4 LY294002對干擾miR-320處理的高糖作用的胰島β細(xì)胞損傷及LDH的影響/±s

3 討論

miR-320已被報道參與多種病理過程。如膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中miR-320表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-320可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中，下調(diào)miR-320表達(dá)可減少線粒體膜電位的丟失，抑制心肌細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)miR-320則具有相反的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)后MIN6細(xì)胞中miR-320表達(dá)水平顯著上調(diào)，與前人研究結(jié)果基本吻合。為探討miR-320在高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞中的作用，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法干擾miR-320表達(dá)，結(jié)果表明干擾miR-320表達(dá)可明顯提高M(jìn)IN6細(xì)胞存活率，減輕高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡。Caspase-3是各種類型細(xì)胞凋亡的最關(guān)鍵的執(zhí)行分子，其通過剪切細(xì)胞凋亡過程中的許多關(guān)鍵蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。LDH是一種較為穩(wěn)定胞質(zhì)酶，正常情況下不能通過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時可釋放到細(xì)胞外，是反應(yīng)細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)后MIN6細(xì)胞Caspase-3表達(dá)、細(xì)胞上清液中LDH活性顯著升高，而干擾miR-320表達(dá)可減輕高糖刺激對Caspase-3表達(dá)和LDH活性的影響。以上數(shù)據(jù)表明，干擾miR-320表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

磷脂酰肌醇-3-羥激酶（Phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/AKT/mTOR是一條經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細(xì)胞功能。激活的PI3K在細(xì)胞膜上產(chǎn)生第二信使磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidyl inositol triphosphate，PIP3），PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH域的信號蛋白AKT和丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK1）結(jié)合，將AKT從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜上，進(jìn)而通過PDK1促使AKT磷酸化導(dǎo)致AKT活化。mTOR是AKT重要的下游因子，活化的AKT可激活mTOR信號通路，進(jìn)而通過一系列途徑促進(jìn)翻譯起始復(fù)合物的形成和蛋白合成。已有研究表明，AKT/mTOR信號通路的激活與胰島β細(xì)胞存活、凋亡密切相關(guān)。例如，竹節(jié)參皂苷可能通過激活A(yù)KT/mTOR信號通路減輕高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷和凋亡。雙芥子粉通過激活A(yù)KT/mTOR途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡和合成代謝有助于維持糖尿病患者的胰島β細(xì)胞功能和形態(tài)。本研究顯示，高糖誘導(dǎo)后MIN6細(xì)胞AKT和mTORC1的磷酸化水平顯著降低，而干擾miR-320表達(dá)可升高高糖誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞中AKT和mTORC1的磷酸化水平，提示AKT/mTOR信號通路的激活可能與干擾miR-320表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷的保護(hù)作用有關(guān)。為進(jìn)一步驗證AKT/mTOR信號通路的作用，使用AKT特異性抑制劑LY294002阻斷AKT/mTOR途徑，結(jié)果顯示LY294002能夠增強高糖刺激對MIN6細(xì)胞存活、凋亡、Caspase-3表達(dá)和LDH活性的影響，而LY294002卻大大降低干擾miR-320表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。以上研究結(jié)果提示，干擾miR-320表達(dá)通過調(diào)控AKT/mTOR途徑對高糖誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究表明干擾miR-320表達(dá)通過激活A(yù)KT/mTOR信號通路能夠保護(hù)高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡和損傷，這為miRNA在糖尿病發(fā)展過程中的作用提供了重要的見解，為今后為2型糖尿病治療指明了方向。