郭亮，李真真，王一平，寇儒

多發(fā)性骨髓瘤是一種漿細胞惡性腫瘤，在骨髓中積聚，導致骨髓破壞和骨髓衰竭，它是僅次于非霍奇金淋巴腫瘤的血液惡性腫瘤。在美國和歐洲，多發(fā)性骨髓瘤的年發(fā)病率為40%～60%，在中國為10%～25%，好發(fā)于老年人，其主要臨床表現貧血、出血、骨痛或骨折、高鈣癥、腎功能不全及免疫功能低下等。國內外學者對骨髓瘤的治療及研究多集中于細胞遺傳學、分子生物學及骨髓微環(huán)境上，而近期對于非編碼蛋白基因的研究發(fā)現，miRNAs（微小RNA）分子組成的網絡結構也參與了骨髓瘤細胞的生長和生存。miRNAs是一類小分子的非編碼單鏈RNA的基因產物，長度約為20～25個核苷酸，能夠在轉錄后對靶基因表達水平進行調控。目前已經證實，miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關，是一類潛在的促癌或抑癌基因。miR-520g（微小RNA-520g）屬于miR-515（微小RNA-515）家族成員，表達于胎盤細胞及某些腫瘤組織中。近年研究發(fā)現，miR-520g是糖酵解調控的中間調控因子，與肝癌病人的整體生存率相關。miR-532（微小RNA-532）已被證實與多種腫瘤相關。Zhang等發(fā)現miR-532-5p（微小RNA-532-5p）在胃癌細胞中低表達，且miR-532-5p的低表達與胃癌病人的不良預后相關。miR-520g、miR-532在不同腫瘤中有特異性表達，但在多發(fā)性骨髓瘤中的研究較少，本研究探討了二者在多發(fā)性骨髓瘤中的表達水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月至2019年7月西安市中心醫(yī)院收治的多發(fā)性骨髓瘤病人80例為觀察組，年齡（58.8±7.3）歲，其中男性46例，女性34例。同時選取同期進行髂骨穿刺并明確骨髓功能無異常的非血液病病人80例為對照組，年齡（57.2±8.9）歲；其中男性43例，女性37例。兩組年齡、性別差異無統計學意義（

t

=1.243，

P

=0.216；

χ

=0.228，

P

=0.633）。納入標準：①觀察組骨髓組織按照世界衛(wèi)生組織（WHO）多發(fā)性骨髓瘤標準診斷；②既往無血液系統疾病史；③臨床病理資料完整，病人及其近親屬均知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學協會赫爾辛基宣言》相關要求。排除標準：①合并急性感染性疾??；②合并其它器官的惡性腫瘤；③妊娠期或哺乳期婦女。

根據國際分期系統（international staging system，ISS）進行分期：其中Ⅰ期病人36例，Ⅱ期病人28例，Ⅲ期病人16例。根據骨髓漿細胞比例進行分組：骨髓漿細胞＜10%有13例為低度分化；10%～30%有30例 為 中 度 分 化；≥30%有37例 為 高 度分化。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol RNA提取試劑盒（上海閃晶分子生物科技有限公司，貨號ZN00801），反轉錄試劑盒（北京紐樸生物技術有限公司，貨號205311），miR-520g、miR-532檢測試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）；ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀（北京安麥格貿易有限公司）、臺式超速離心機（上海培清科技股份有限公司，PQ-1600A）。

1.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測骨髓組織中miR-520g、miR-532表達水平

留取兩組受試者髂骨穿刺時的骨髓標本組織，采用qRTPCR法測定其中miR-520g、miR-532表達量。采用Trizol法提取骨髓組織中總RNA并溶于20 μLDEPC水中，操作步驟按照Trizol試劑盒說明書進行，應用反轉錄合成cDNA，反應體系：逆轉錄產物10 μL，25 mmol MgCl（氯化鎂）4 μL，10×PCR反應緩沖液8 μL，TaqDNA酶1 μL，引物20 pmol/L，補充DEPC處理過的水至終體積100 μL。反應條件：95℃、1 min，95℃、15 s，60℃、1 min，72℃、10 s，共40個循環(huán)。miR-520g、miR-532均以U6作為內參，引物序列見表1。采用Folds=2計算基因的相對表達量。

表1 引物序列表

2 結果

2.1 兩組骨髓組織中miR-520g、miR-532表達水平

如表2所示，與對照組相比，觀察組病人骨髓組織中miR-520 g表達水平升高，miR-532表達水平降低，差異有統計學意義（

P

＜0.05）。

表2 兩組骨髓組織中miR-520g、miR-532表達水平比較/±s

2.2 miR-520g、miR-532表達水平與多發(fā)性骨髓瘤臨床病理特征的相關性

以多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g水平平均數（3.70±0.70）分為miR-520g高表達組39例，低表達組41例；以多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-532（0.90±0.24）表達水平平均數分為miR-532高表達組42例，低表達組38例。多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g、miR-532與病人年齡、性別、一般分型無關（

P

＞0.05），與臨床分期、分化程度、是否發(fā)生淋巴結轉移相關（

P

＜0.05）。詳見表3。

表3 多發(fā)性骨髓瘤臨床病理特征與miR-520g、miR-532表達水平的相關性/例

2.3多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g與miR-532表達的相關性

Pearson分析結果顯示，多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g與miR-532表達呈負相關（

r

=-0.426，

P

＜0.001），見圖1。

圖1 多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g與miR-532表達水平相關性

2.4 miR-520g與miR-532對多發(fā)性骨髓瘤的診斷價值

ROC曲線結果顯示，骨髓組織中miR-520g表達水平診斷多發(fā)性骨髓瘤的曲線下面積（AUC）為0.827，敏感度為73.8%，特異性為80.0%，95%

CI

為0.764～0.889；骨髓組織中miR-532表達水平診斷多發(fā)性骨髓瘤的AUC為0.855，敏感度為82.5%，特異性為75.0%，95%CI為0.797～0.912。二者聯合診斷多發(fā)性骨髓瘤的AUC達到0.922，敏感度為81.3%，特異性為91.2%。詳見表4、圖2。

表4 骨髓組織中miR-520g與miR-532表達水平對多發(fā)性骨髓瘤的診斷價值分析

圖2 miR-520g與miR-532對多發(fā)性骨髓瘤的診斷價值

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤源于免疫系統淋巴細胞，是一種發(fā)病率較高的血液系統惡性腫瘤，占所有腫瘤發(fā)生率的1%，預后較差。流行病學調查顯示，近年來多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病率逐年上升，每年約有52 000人死于多發(fā)性骨髓瘤，目前對于多發(fā)性骨髓瘤的病因及發(fā)病機制尚無統一學說，已有認識包括兩方面：遺傳學改變和細胞因子作用。miRNA的發(fā)現為進一步研究提供了新方向。近年來，隨著miRNA的研究不斷深入，許多學者對其研究取得了突破性進展。研究表明，miRNAs表達水平的變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。miRNAs可能參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生過程，并在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)揮致癌或抑癌作用。例如，嚴笑等研究表明，miRNA-181a（微小RNA-181a）在多發(fā)性骨髓瘤中高表達，沉默miRNA-181a的表達能夠抑制多發(fā)性骨髓瘤RPM18226細胞的增殖，并降低細胞的遷移能力。

miR-520g是miR-515家族成員之一，在胎盤細胞及腫瘤組織中廣泛表達。miR-520g能通過基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）參與子宮內膜異位癥的發(fā)生。有研究表明，miR-520g可能通過抑制Smad7蛋白的表達促進肝癌細胞遷移及上皮細胞間質轉型。也有研究證實，miR-520基因在腦腫瘤細胞中高表達，生長在腫瘤球體內的細胞內源性表達miR-520g會導致組織凝血活酶下調，提示miR-520g可以通過控制血管生成來實現對腫瘤血管微環(huán)境的調控，并與凝血調節(jié)之間存在關聯。miR-520g在腫瘤中的研究較多，但在血液系統腫瘤中研究較少。本研究結果顯示，與對照組相比，miR-520g在多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中呈高表達，提示miR-520g與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生有關。且miR-520g表達與多發(fā)性骨髓瘤的臨床分期、分化程度、是否發(fā)生淋巴結轉移相關，與病人的年齡、性別、一般分型無關，提示miR-520g可能參與了多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展。另ROC結果顯示，miR-520g診斷多發(fā)性骨髓瘤的ROC曲線下面積為0.827，敏感度為73.8%，特異性為80.0%，95%

CI

為0.764～0.889，說明miR-520g能夠較好的區(qū)分多發(fā)性骨髓瘤病人與正常受試者。miR-532位于人染色體XP11.23，它的序列在哺乳動物中是高度保守的，位于micro-188上游的400 nt單位。研究表明，miR-532在大腸癌組織和細胞系中顯著下調，通過直接靶向胰島素樣生長因子1受體和調控PI3K/Akt信號通路在大腸癌的發(fā)生中起重要作用。有研究表明，在慢性淋巴細胞白血病中，miR-532表達上調。近年來對miR-532的研究表明其在不同的腫瘤組織中有不同的表達，在血液系統惡性腫瘤中的研究較少，與多發(fā)性骨髓瘤的關系不明確。本研究結果顯示，與對照組相比，多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-532呈低表達，提示miR-532表達水平與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生存在聯系。多發(fā)性骨髓瘤病人臨床病理指標與miR-532的相關性分析結果顯示，miR-532表達與病人的年齡、性別及多發(fā)性骨髓瘤的一般分型無關，與多發(fā)性骨髓瘤的臨床分期、分化程度、是否發(fā)生淋巴結轉移相關。提示miR-532可能參與了多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病、發(fā)展。本研究Pearson分析結果顯示，miR-520g與miR-532表達呈負相關（

P

＜0.05），提示miR-520g與miR-532可能以某種機制參與了多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生，其具體互作機制有待進一步研究。另ROC結果顯示，miR-532診斷多發(fā)性骨髓瘤的ROC曲線下面積為0.855，敏感度為82.5%，特異性為75.0%，95%

CI

為0.797～0.912，miR-520g與miR-532聯合診斷多發(fā)性骨髓瘤的ROC的曲線下面積為0.922，敏感度為81.3%，特異性為91.2%，二者聯合診斷多發(fā)性骨髓瘤能達到較好效果，提示miR-520g與miR-532聯合檢測可作為診斷多發(fā)性骨髓瘤的潛在生物學指標。

綜上所述，多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g呈高表達，miR-532呈低表達，二者呈負相關，且均與臨床分期、分化程度、是否發(fā)生淋巴結轉移等臨床病理特征相關，兩者聯合檢測對多發(fā)性骨髓瘤具有一定診斷價值。