宋現(xiàn)靜，劉明，呂文山

糖尿病腎病屬于糖尿病慢性并發(fā)癥，隨著疾病發(fā)展可引發(fā)終末期腎病。既往研究顯示免疫與炎癥反應失衡與糖尿病腎病病人足細胞損傷密切相關。研究表明微小RNA-103（miR-103）在2型糖尿病大鼠外周血單核細胞中高表達。TargetScan預測顯示鈣調磷酸酶調節(jié)蛋白RCAN 1（regulator of calcineurin 1，RCAN 1），可能是miR-103的靶基因，研究表明敲除RCAN1可加重阿霉素腎病小鼠的蛋白尿及足細胞損傷。本研究從2018年1月至2019年1月期間主要探究miR-103在高糖誘導的足細胞中的表達變化，分析干擾miR-103的表達對高糖誘導的足細胞凋亡及炎性因子分泌的影響，初步探討miR-103對RCAN1的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人足細胞（human podocytecell，HPC）購自美國ATCC細胞庫。Trizol試劑、RT Reagent Kit With gDNA Eraser與SYBR Premix Ex Taq試劑均購自日本TaKaRa公司；兔抗人RCAN1、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體均購自美國Abcam公司；HRP標記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒購自上海江萊生物股份有限公司；miR-103特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-103）及其陰性對照（anti-miR-con）、miR-103寡核苷酸模擬物（miR-103 mimics）及 陰 性 對 照mimic NC序 列（miR-con）、RCAN1小分子干擾RNA（si-RCAN1）及其陰性對照（si-con）均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組HPC細胞接種于6孔板，待HPC細胞分化成熟進行高糖刺激，25 mmol/L高糖分別刺激6、12、24 h，檢測各組足細胞凋亡率，篩選適宜濃度進行后續(xù)實驗。實驗分組：正常糖組（NG組）、高糖（HG）6 h組、HG12 h組、HG 24 h組。干擾miR-103表達對高糖刺激人足細胞凋亡和炎性因子分泌的影響。實驗分組：HG+anti-miR-con組（足細胞中轉染anti-miR-con 24 h，含有25 mmol/L高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h）、HG+anti-miR-103組（足細胞中轉染anti-miR-103 24 h，含有25 mmol/L高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h）。miR-103調控RCAN1的表達，實驗分組：miR-con組（HPC細胞中轉染miR-con 24h）、miR-103組（HPC細胞中轉染miR-103 mimics 24 h）、anti-miR-con組（HPC細胞中轉染anti-miR-con 24 h）、anti-miR-103組（HPC細胞中轉染anti-miR-103 24 h）。過表達RCAN1對高糖刺激人足細胞凋亡和炎癥因子分泌的影響，實驗分組：HG+pcDNA組（HPC細胞中轉染pcDNA 24 h，含有25 mmol/L高糖 的 培 養(yǎng) 液 培 養(yǎng)12 h）、HG+pcDNA-RCAN1組（HPC細胞中轉染pcDNA-RCAN1 24 h，含有25 mmol/L高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h）。干擾RCAN的表達聯(lián)合干擾miR-103的表達對高糖刺激人足細胞的作用，實驗分組：HG+anti-miR-103+si-con組（HPC細胞共轉染anti-miR-103與si-con 24 h，含有25 mM高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h）、HG+anti-miR-103+si-RCAN1組（HPC細胞共轉染anti-miR-103與si-RCAN1 24 h，含有25 mmol/L高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h）。

1.2.2 qRT-PCR檢 測 細 胞 中miR-103、RCAN1 mRNA表達水平取各組HPC細胞，提取RNA。按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄為cDNA。qRT-PCR反應：以cDNA為模板，反應條件為95℃、2 min，95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共循環(huán)40次。采用2法計算miR-103、RCAN1 mRNA相對表達量。

1.2.3 檢測細胞中IL-6、TNF-α含量收集各組細胞培養(yǎng)液，按照酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒說明書進行操作、檢測IL-6、TNF-α含量。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡收集各組HPC細胞10 000 r/min轉速離心5 min（4℃），PBS洗滌，加入1 mL結合緩沖液，相同條件下離心，棄上清，分別加入200 μL結合緩沖液，按照凋亡檢測試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.2.5 熒光素酶報告基因檢測野生型載體WTRCAN1與突變型載體MUT-RCAN1，取HPC細胞，將WT-RCAN1、MUT-RCAN1分別與miR-103 mimics、miR-con共轉染至HPC細胞，37℃恒溫培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞，按照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.2.6 Western blotting檢測RCAN1、Bax、Bcl-2蛋白表達取各組HPC細胞，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，取變性蛋白進行SDS-PAGE，每孔蛋白上樣量30 μg，轉膜，室溫條件下采用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入蛋白一抗稀釋液（1∶500），加入二抗稀釋液（1∶1 000），應用凝膠成像系統(tǒng)及Quantity one軟件檢測條帶灰度值。

2 結果

2.1 不同濃度高糖刺激對人足細胞miR-103和RCAN1表達的影響

用不同濃度的高糖刺激足細胞，結果顯示，與NG組相比，HG 6 h組、HG 12 h組、HG 24 h組足細胞中miR-103的表達水平升高（

P

＜0.05），RCAN1 mRNA及蛋白的表達水平降低（

P

＜0.05），見圖1、表1。

圖1 檢測人足細胞中鈣調磷酸酶調節(jié)蛋白（RCAN）表達

表1 不同濃度高糖誘導人足細胞miR-103和RCAN1的表達/±s

2.2 不同高糖刺激時間對人足細胞凋亡和炎癥因子分泌的影響

與NG組相比，HG 6h組、HG12 h組、HG 24 h組足細胞凋亡率、Bax蛋白表達量、IL-6、TNF-α水平升高（

P

＜0.05），Bcl-2蛋白表達量降低（

P

＜0.05），其中HG12 h作用效果較好，用于后續(xù)研究，見圖2、表2。

表2 不同高糖刺激時間對人足細胞凋亡和炎性因子分泌的影響/±s

圖2 檢測人足細胞凋亡率（A）和凋亡相關蛋白表達（B）

2.3 干擾miR-103表達抑制高糖刺激人足細胞凋亡和炎性因子分泌

實驗結果顯示，與HG+antimiR-con組相比，HG+anti-miR-103組高糖刺激的足細胞中miR-103的表達水平、細胞凋亡率、Bax蛋白表達量、IL-6、TNF-α水平降低（

P

＜0.05），Bcl-2蛋白表達量升高（

P

＜0.05），見圖3、表3。

表3 干擾miR-103表達抑制高糖刺激人足細胞凋亡和炎癥因子分泌/±s

圖3 檢測人足細胞凋亡相關蛋白表達

2.4 miR-103抑 制RCAN1

miR-103與RCAN1互補的核苷酸序列，見圖4A。轉染克隆有RCAN1-3’UTR載體質粒實驗中，miR-103組熒光素酶活性明顯受到抑制，與miR-con組比較，熒光素酶活性差異有 統(tǒng) 計 學意 義［（1.00±0.08）比（0.43±0.05）］（

t

=18.126，

P

＜0.05）；轉染MUT-RCAN1實驗中，miR-con組與miR-103組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義［（0.98±0.11）比（1.16±0.13）］（

t

=3.171，

P

=0.006）。miR-103可 負 向 調 控RCAN1的 表 達。miR-con組、miR-103組、anti-miR-con組、anti-miR-103組RCAN1蛋白水平分別為（0.46±0.06）、（0.21±0.04）、（0.45±0.05）、（0.73±0.07），差異有統(tǒng)計學意義（

F

=129.024，

P

＜0.05），見圖4B。

圖4 miR-103與鈣調磷酸酶調節(jié)蛋白1（RCAN1）互補的核苷酸序列（A）以及miR-103調控RCAN1表達（B）

2.5 過表達RCAN1抑制高糖刺激人足細胞凋亡和炎性因子分泌

實驗結果顯示，相較于HG+pcDNA組，HG+pcDNA-RCAN1組足細胞中RCAN1、Bcl-2蛋白表達量升高（

P

＜0.05），細胞凋亡率、Bax蛋白表達量、IL-6、TNF-α水平降低（

P

＜0.05），見圖5、表4。

表4 過表達RCAN1對人足細胞增殖和凋亡的影響/±s

圖5 檢測人足細胞中鈣調磷酸酶調節(jié)蛋白1（RCAN1）表達和凋亡相關蛋白表達

2.6 干擾RCAN1表達部分逆轉干擾miR-103表達對高糖刺激人足細胞的保護作用

實驗結果顯示，與HG+anti-miR-103+si-con組比較，HG+anti-miR-103+si-RCAN1組足細胞中RCAN1、Bcl-2蛋白表達量降低（

P

＜0.05），細胞凋亡率、Bax蛋白表達量、IL-6、TNF-α水平升高（

P

＜0.05），見表5、圖6。

圖6 檢測人足細胞中鈣調磷酸酶調節(jié)蛋白1（RCAN1）表達

表5 干擾RCAN1表達部分逆轉干擾miR-103表達對人足細胞增殖和凋亡的作用/±s

3 討論

糖尿病腎病的主要病理特征為腎小球硬化與足細胞損傷，臨床癥狀主要為尿素氮排泄障礙與尿蛋白排泄增多。研究表明腎小球濾過屏障的主要組成部分是足細胞，而足細胞損傷與腎小球疾病密切相關。因而探究糖尿病腎病足細胞損傷機制對防治糖尿病腎病具有重要意義。

miR-103在缺氧誘導的肺動脈高壓鼠的肺組織中表達升高，并可參與肺動脈平滑肌細胞的增殖從而促使血管重塑。研究表明miR-103可參與心肌細胞壞死過程，抑制miR-103的表達可抑制心肌細胞壞死。相關報道指出抑制miR-103的表達可提高2型糖尿病小鼠體內葡萄糖穩(wěn)態(tài)及胰島素敏感性。本研究結果顯示足細胞中miR-103的表達水平顯著升高，足細胞凋亡能力增強，Bax表達上調而Bcl-2表達下調。Bax可促進細胞凋亡，而Bcl-2可抑制細胞凋亡。本研究結果顯示干擾miR-103的表達可通過上調Bcl-2的表達及下調Bax的表達從而抑制高糖誘導的足細胞凋亡。研究表明足細胞的凋亡、炎癥及足突異常改變等均可降低腎功能，炎性因子IL-6、TNF-α水平增加導致足細胞出現(xiàn)炎性反應。本研究結果顯示高糖刺激條件下足細胞中IL-6、TNF-α含量顯著升高，表明高糖刺激下足細胞固有免疫被激活從而產(chǎn)生炎性反應。本研究發(fā)現(xiàn)干擾miR-103的表達可降低IL-6、TNF-α水平，提示干擾miR-103的表達可減輕高糖刺激下足細胞的炎性反應。

RCAN1表達異常與胰島素抵抗、β細胞線粒體功能障礙及胰島素分泌功能密切相關。研究表明RCAN1表達量降低與2型糖尿病中線粒體功能異常有關。本研究發(fā)現(xiàn)在高糖刺激的足細胞中RCAN1表達量顯著降低，提示RCAN1的表達變化可能與足細胞損傷有關。本研究采用過表達載體上調RCAN1的表達，通過觀察足細胞凋亡及炎性因子分泌情況推斷RCAN1在足細胞損傷過程中的作用，結果顯示RCAN1過表達可抑制高糖誘導的足細胞凋亡，能夠顯著降低IL-6、TNF-α水平，提示RCAN1過表達對足細胞具有保護作用。本研究證實RCAN1是miR-103的靶基因，干擾miR-103的表達可通過上調RCAN1的表達而保護糖尿病腎病足細胞。

綜上所述，糖尿病腎病足細胞中miR-103表達升高，而RCAN1表達下調，干擾miR-103的表達可通過上調RCAN1的表達而保護足細胞，并可抑制足細胞凋亡及減輕炎癥反應從而避免足細胞損傷，為臨床治療糖尿病腎病提供新方向。但關于miR-103與RCAN1是否在內皮細胞與系膜細胞中表達仍未可知，仍需進一步驗證miR-103對糖尿病腎病病人腎臟損傷的影響。