曹峰，劉敏,趙瀟

肝細胞癌是最常見的類型，占肝癌的70%～85%。外科手術(shù)仍是肝癌的主要治療措施，早期肝癌病人通過手術(shù)治療，如切除部分肝臟或移植，病人5年存活率超過70%。然而，大多數(shù)中晚期肝癌病人5年生存率約為15%。近期研究顯示，在圍術(shù)期使用的麻醉劑能夠影響病人預(yù)后及腫瘤復(fù)發(fā)。在圍術(shù)期有效抑制腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移是臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點。

舒芬太尼是臨床上常用的麻醉誘導(dǎo)和輔助麻醉劑，其屬于苯基哌啶類強效阿片類藥物。目前關(guān)于舒芬太尼對肝癌細胞侵襲和遷移影響的研究鮮有報道，并且其作用機制尚不明確。多項研究指出微小RNA-1（microRNA-1，miR-1）在人類多種惡性腫瘤，如結(jié)直腸癌、前列腺癌和膀胱癌等中表達下調(diào)。有關(guān)報道顯示，miR-1能夠抑制肝癌細胞增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細胞凋亡。近期有研究顯示，舒芬太尼可通過調(diào)控miR-1對大鼠心肌缺血再灌注損傷起保護作用。提示舒芬太尼可能對miR-1的表達具有調(diào)控作用。

本研究起止時間為2018年3月至2019年9月，通過觀察舒芬太尼對人肝癌MHCC97-H細胞增殖、侵襲和遷移及miR-1表達的影響，探究舒芬太尼對肝癌細胞影響的機制，以期為舒芬太尼在肝癌治療中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞株MHCC97-H購自中國科學(xué)院上海細胞研究所；枸櫞酸舒芬太尼注射液購自宜昌人福藥業(yè)有限公司；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基購自美國Hyclon公司；胰蛋白酶和新生小牛血清購自美國Gibco公司；Cell Counting Kit（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑購自日本同仁研究所；Trizol試劑購自美國Ambion公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-1抑制劑（inhibitor）和陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Corning公司；基質(zhì)膠（Matrigel）購自美國BD公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、放射免疫沉淀法（RIPA）細胞裂解試劑、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）單抗及辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG均購自美國CST公司；實驗所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞MHCC97-H常規(guī)復(fù)蘇后培養(yǎng)在含10%滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入100 μg/mL青霉素-鏈霉素，放入體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，細胞貼壁生長，每隔2天換液1次，待細胞生長密度達80%以上時，以0.25%胰蛋白酶消化細胞，按照1∶3或1∶4的比例進行傳代培養(yǎng)。

1.3 CCK-8檢測舒芬太尼對MHCC97-H細胞活力的影響

對數(shù)期的MHCC97-H細胞以胰酶消化，計數(shù)后取100 μL細胞懸液加入到96孔板中，每孔約5×10個細胞，放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，棄去就培養(yǎng)液，加入含不同濃度（0、0.01、0.1、1、10、20 μmol/L）舒芬太尼的培養(yǎng)液，分別孵育24、48、72 h，在各個時間點向細胞中加入CCK-8溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度值（optical density，OD），分別計算各組MHCC97-H細胞活力，細胞活力（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.4 細胞分組和處理

對數(shù)生長期的MHCC97-H細胞接種到6孔板中，接種密度為2×10個/孔，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，將細胞隨機分為4組：對照（Control）組即未做任何處理的MHCC97-H細胞；舒芬太尼（Sufentanil）組即1 μmol/L舒芬太尼干預(yù)的MHCC97-H細胞；舒芬太尼和轉(zhuǎn)染（Sufentanil+miR-1）組即轉(zhuǎn)染miR-1 inhibitor后施加1 μmol/L舒芬太尼干預(yù)的MHCC97-H細胞；舒芬太尼和對照（Sufentanil+NC）組即轉(zhuǎn)染陰性對照后施加1 μmol/L舒芬太尼干預(yù)的MHCC97-H細胞。細胞轉(zhuǎn)染嚴(yán)格參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明書進行操作，各組MHCC97-H細胞處理48 h后進行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.5 qRT-PCR檢測

各組MHCC97-H細胞處理48 h后，收集細胞，采用Trizol試劑分別提取MHCC97-H細胞中總RNA，使用Nanodrop超微量核酸蛋白檢測儀測定RNA的豐度和純度。選擇合格的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板，以U6為內(nèi)參，采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增，反應(yīng)程序設(shè)為：94℃預(yù)變性5 min，共1個循環(huán)；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后獲取Ct值，并采用相對定量2法分別計算各組MHCC97-H細胞中miR-1相對表達量。所用引物：miR-1 5’-TAGAAGCTTGCCTCTGAGCTGCCTTCTCTA-3’。U6 F-5’-CTTCGGCACGCACATATAC-3’；R-5’-GAACGCTTCACGAATTTGC-3’。

1.6 Western blotting檢測

各組MHCC97-H細胞棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次，用細胞刮刮下細胞，收集細胞，加入配置好的RIPA細胞裂解液，于冰上裂解細胞，離心后收集上清即總蛋白。分別配制12%分離膠和4%濃縮膠，取40 μg蛋白樣品分別加入到每個泳道中，調(diào)整電壓行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后斷開電源，將凝膠上的蛋白采用半干法電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，于5%小牛血清的封閉液中孵育2 h，TBST沖洗膜3次，分別加入1∶500稀釋的一抗，冰上過夜孵育，TBST沖洗膜3次，再加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，TBST沖洗膜3次，化學(xué)發(fā)光顯影，采用成像系統(tǒng)采集圖像，使用Image J軟件分析圖像中的各條帶灰度值，以β肌動蛋白（β-actin）進行標(biāo)定，計算各組MGC-803細胞中MMP-2和MMP-9蛋白相對表達水平。

1.7 Transwell實驗

以胰酶消化各組MHCC97-H細胞，離心收集并將細胞密度調(diào)整至2×10個/毫升。取200 μL細胞懸液加入到Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室的上室，在下室加入含10%小牛血清的培養(yǎng)液600 μL，放置在37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出小室后棄去培養(yǎng)液，使用棉簽輕輕擦去上室未穿膜的細胞和基質(zhì)膠，經(jīng)無水甲醇固定后，漂洗晾干，再使用0.1%結(jié)晶紫染色，以PBS洗滌3遍，使用倒置顯微鏡（400倍）觀察，隨機選取5個視野觀察并進行計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.8 劃痕實驗

將各處理組MHCC97-H細胞以1×10個/平鋪于6孔板上，在常規(guī)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞呈單層匯合時，用無菌移液槍槍頭垂直劃線，用PBS洗去劃下的細胞，加入不含血清的培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別在0和48 h在光鏡下觀察并記錄細胞劃痕距離。分別計算各組MHCC97-H細胞的遷移率，細胞遷移率（%）=（0 h劃痕距離-48 h劃痕距離）×100%。

2 結(jié)果

2.1 舒芬太尼對肝癌MHCC97-H細胞活力的影響

CCK-8檢測不同濃度舒芬太尼干預(yù)24、48、72 h對肝癌MHCC97-H細胞活力的影響，隨著舒芬太尼濃度的升高MHCC97-H細胞活力隨之下降，在干預(yù)24 h時，舒 芬 太 尼 的 濃 度 達 到10 μmol/L時MHCC97-H細胞活力降低（

P

＜0.05），在干預(yù)48 h時，舒芬太尼的濃度達到1 μmol/L時細胞活力降低（

P

＜0.05）?；谠搶嶒灪Y選出舒芬太尼干預(yù)MHCC97-H細胞最適作用濃度為1 μmol/L，最適作用時間為48 h。見表1。

表1 不同濃度的舒芬太尼對肝癌MHCC97-H細胞活力的影響/±s

2.2 各組MHCC97-H細胞miR-1表達比較

在MHCC97-H細胞轉(zhuǎn)染miR-1 inhibitor后采用1 μmol/L舒芬太尼進行干預(yù)，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，Sufentanil組MHCC97-H細胞中miR-1的表達水平（2.25±0.24）高 于Control組（1.00±0.09）（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組MHCC97-H細 胞 中miR-1的 表達 水 平（1.42±0.15）低 于Sufentanil+NC組（2.20±0.21）（

P

＜0.05）；而Sufentanil組和Sufentanil+NC組中miR-1的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。

2.3 各組MHCC97-H細胞增殖能力比較

CCK-8實驗結(jié)果顯示，Sufentanil組MHCC97-H細胞OD值（0.34±0.03）明 顯 低 于Control組（0.54±0.05）（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組MHCC97-H細 胞OD值（0.46±0.04）明顯高于Sufentanil+NC組（0.32±0.03）（

P

＜0.05）；而Sufentanil組和Sufentanil+NC組細胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。

2.4 各組MHCC97-H細胞侵襲和遷移能力比較

Transwell實驗結(jié)果顯示，Sufentanil組侵襲細胞數(shù)明顯少于Control組（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組侵襲細胞數(shù)明顯多于Sufentanil+NC組（

P

＜0.05）。劃痕實驗結(jié)果顯示，Sufentanil組細胞遷移率明顯低于Control組（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組細胞遷移率明顯高于Sufentanil+NC組（

P

＜0.05）。見表2。

表2 各組MHCC97-H細胞侵襲細胞數(shù)和細胞遷移率比較/±s

2.5 各 組MHCC97-H細 胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平比較

Western blotting檢測結(jié)果顯示，Sufentanil組MHCC97-H細胞 中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平低于Control組（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組MHCC97-H細 胞中MMP-2和MMP-9蛋 白表達水平明顯低于Sufentanil+NC組（

P

＜0.05）；而Sufentanil組 和Sufentanil+NC組 細 胞 中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見圖1和表3。

圖1 Western blotting檢測各組MHCC97-H細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

表3 各組MHCC97-H細胞中MMP-2和MMP-9表達水平比較/±s

3 討論

舒芬太尼常做麻醉輔助藥物用于癌癥手術(shù)中，近年來，舒芬太尼等阿片類藥物對腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等影響受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。但關(guān)于其對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響亟待研究。因此，本研究采用不同濃度的舒芬太尼干預(yù)人肝癌MHCC97-H細胞，CCK-8實驗結(jié)果顯示，不同濃度的舒芬太尼對MHCC97-H細胞活力具有不同程度的抑制作用。基于CCK-8實驗結(jié)果篩選出最適作用濃度1 μmol/L和最適作用時間48 h，以用于后續(xù)實驗加藥標(biāo)準(zhǔn)濃度及處理時間。此外本實驗qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼處理后MHCC97-H細胞中miR-1的表達水平明顯升高，這與Qiao等人的研究相似，提示舒芬太尼可能調(diào)控miR-1的表達。

miR-1能夠參與調(diào)控人類多種惡性腫瘤的發(fā)生和進展。Xie等報道指出，miR-1在胃癌組織和細胞系中的表達明顯降低，在胃癌細胞中過表達miR-1能夠抑制內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管形成，起到腫瘤抑制劑的作用。另一項研究指出，miR-1在卵巢癌組織中表達下調(diào)，并且可能通過抑制c-Met表達抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲。在肝癌中，miR-1亦呈低表達，且miR-1可能通過抑制死亡結(jié)構(gòu)域沉默子（BAG4）的表達誘導(dǎo)肝癌Hep3B細胞發(fā)生凋亡。為探究舒芬太尼通過調(diào)控miR-1的表達影響肝癌MHCC97-H細胞體外增殖、侵襲和遷移能力，本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染至MHCC97-H細胞下調(diào)miR-1的表達。CCK-8、Transwell實驗和劃痕實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼能夠抑制MHCC97-H細胞增殖、侵襲和遷移，而下調(diào)miR-1的表達能夠部分逆轉(zhuǎn)舒芬太尼誘導(dǎo)的細胞增殖、侵襲和遷移抑制作用。本研究表明，舒芬太尼可能通過調(diào)控miR-1的表達來影響MHCC97-H細胞增殖、侵襲和遷移。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的過程，包括腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤部位脫離，侵犯周圍正常組織，并轉(zhuǎn)移到遠處部位繼續(xù)增殖形成繼發(fā)瘤。在該過程中，細胞外基質(zhì)被降解，血管基底膜被破壞，這些均與基質(zhì)金屬蛋白酶密切相關(guān)。MMP-2和MMP-9均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族重要成員，其主要功能是降解細胞外基質(zhì)蛋白成分。研究顯示，MMP-2和MMP-9表達量與腫瘤細胞侵襲和遷移能力呈正相關(guān)。本研究通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼干預(yù)的MHCC97-H細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達降低，而下調(diào)miR-1的表達后MMP-2和MMP-9蛋白表達水平可部分恢復(fù)。表明舒芬太尼通過抑制miR-1的表達對MHCC97-H細胞侵襲和遷移能力的抑制作用可能通過下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達實現(xiàn)的。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)舒芬太尼能夠抑制肝癌MHCC97-H細胞增殖、侵襲和遷移，其作用機制可能與抑制MHCC97-H細胞中miR-1的表達有關(guān)。