高妍，過立農(nóng)，劉杰，馬雙成，鄭健，昝珂

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

草烏是一種常用中藥材，味辛、苦，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效。2020 年版《中國藥典》（一部）收載草烏為毛茛科植物北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥塊根，主要用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛［1］。草烏主要分布于山西、河北、內(nèi)蒙古和東北三省等地［2］，有大毒，含有烏頭堿等雙酯型生物堿等劇毒成分，需炮制后使用［3-5］。

制草烏屬于草烏的加工炮制品，功效同草烏，是104 個中藥成方制劑的處方藥味?？偵飰A為制草烏的有效成分和毒性成分。草烏經(jīng)炮制后，毒性強的雙酯型生物堿水解為單酯型生物堿。研究表明，雖然單酯型生物堿的毒性是雙酯型生物堿毒性的1／150～1／500，但毒性依然較強，長期或超量使用會引起中毒癥狀，如口唇和四肢麻痹等，嚴重者可危及生命［6-8］。2020 年版《中國藥典》中制草烏含量測定項下規(guī)定，制草烏中含苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的總量應(yīng)為0.020%～0.070%［1］。

在近幾年開展的藥材市場抽樣檢驗工作中，發(fā)現(xiàn)一種制草烏偽品，該偽品經(jīng)中國食品藥品檢定研究院鑒定為毛茛科植物準噶爾烏頭Aconitum soongaricum (Regel)Stapf 干燥根的炮制品。對收集的制草烏偽品按照2020 年版《中國藥典》（一部）相關(guān)規(guī)定進行測定，發(fā)現(xiàn)樣品中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的總量結(jié)果均不符合規(guī)定，若制劑投料中混有該偽品，將造成安全隱患。

采用高效液相色譜（HPLC）法測定制草烏藥材中的生物堿已有報道［9-15］，但制草烏的特征圖譜以及3 種指標性成分的含量比例特征，特別是結(jié)合偽品進行分析，尚未有報道。筆者采用HPLC 法建立了制草烏和偽品的特征圖譜，并對苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿3 種有效成分開展含量測定，分析并探討制草烏及其偽品的含量特征，建立制草烏準確、快速的鑒別方法，為規(guī)范制草烏藥材的使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Agilent 1260 型，配備二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技公司。

電子天平：（1）QUINTIX313-1CN 型，感量為0.1 mg；（2）MSE125 s 型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。

色譜柱： XBridge C18柱（250×4.6 mm，5 μm），填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，沃特世科技（上海）有限公司。

苯甲酰烏頭原堿對照品：純度（質(zhì)量分數(shù)）為97.5%，批號為111794-201304，中國食品藥品檢定研究院。

苯甲酰新烏頭原堿對照品：純度（質(zhì)量分數(shù)）為96.3%，批號為111795-201303，中國食品藥品檢定研究院。

苯甲酰次烏頭原堿對照品：純度（質(zhì)量分數(shù)）為94.6%，批號為111796-201304，中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈、冰乙酸、乙酸銨和異丙醇：均為色譜純，美國Fisher 公司。

三氯甲烷：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

氨水：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

草烏藥材樣品：共收集30 批制草烏藥材樣品。其中20 批正品藥材（編號為1#～20#），經(jīng)中國食品藥品檢定研究院鑒定為毛茛科北烏頭干燥塊根的加工炮制品；10 批偽品（編號為21#～30#）鑒定為毛茛科植物準噶爾烏頭根的加工炮制品。

實驗用水為超純水。

1.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿對照品適量于10 mL 容量瓶中，以異丙醇-三氯甲烷（體積比為1∶1）混合溶液定容至標線，即得各對照品儲備液。再分別取各對照品儲備液適量于容量瓶中，用異丙醇-三氯甲烷（體積比為1∶1）混合溶液定容至標線，即得苯甲酰新烏頭原堿質(zhì)量濃度為68 μg／mL、苯甲酰烏頭原堿質(zhì)量濃度為16 μg／mL、苯甲酰次烏頭原堿質(zhì)量濃度為79 μg／mL 的對照品混合標準溶液。

1.3 供試品溶液的制備

取樣品過355±13 μm 的篩（三號篩），取約2 g粉末，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加氨水3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（體積比為1∶1）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率為250 W，頻率為33 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯補足減失重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，于40 ℃以下減壓回收溶劑至干，向殘渣中精密加入異丙醇-三氯甲烷混合溶液3 mL 溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4 液相色譜條件

色 譜 柱：Waters XBridge C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，沃特世科技（上海）有限公司]；流動相：A 為乙腈-四氫呋喃（體積比為25∶15），B 為0.1 mol／L 乙酸銨水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）；梯度洗脫條件：0～48 min，15%～26%A；流量：1.0 mL／min；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：235 nm。

1.5 制草烏和偽品的特征圖譜的建立

在上述條件下取得制草烏正、偽品色譜圖，采用Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件分析采集得到的數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行峰對齊處理，并指認特征峰。通過精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性考察，對建立的特征圖譜進行驗證。進一步計算特征圖譜與制草烏正品、偽品的相似度以及聚類結(jié)果，分析建立的特征圖譜是否能夠成功鑒別制草烏正、偽品。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜流動相選擇

考察了乙腈-水、乙腈-0.1 mol／L 乙酸銨水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）以及2020 年版《中國藥典》（一部）制草烏項下［1］采用的A 相為乙腈-四氫呋喃（體積比為25∶15），B 相為0.1 mol／L乙酸銨水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）的流動相體系下主成分的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水、乙腈-0.1 mol／L 乙酸銨水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）條件下主成分的色譜峰形不理想且分離度差，因此，最終按照2020 年版《中國藥典》 （一部）制草烏項下“含量測定”的方法進行測定，也因此不再進行方法學(xué)驗證。

2.2 制草烏特征圖譜

分別精密稱量制草烏樣品（樣品1#～20#），按1.3方法制備供試品溶液，分別進樣測量，記錄25 min的高效液相色譜圖見圖1 所示。采用Chempattern化學(xué)計量學(xué)軟件分析采集所得數(shù)據(jù)，將樣品1#設(shè)定為參照圖譜，自動匹配其它樣品，生成制草烏正品的特征圖譜見圖2 所示。對建立的特征圖譜中的3 個特征峰進行指認，采用對照品比對法及DAD 光譜分析法，指認苯甲酰新烏頭原堿為1 號峰，苯甲酰烏頭原堿為2 號峰，苯甲酰次烏頭原堿為3 號峰。

圖2 制草烏HPLC 特征圖譜

2.2.1 系統(tǒng)適用性

在1.4 色譜條件下，分別對制草烏（樣品4#）、偽品（樣品23#）、對照品溶液進行檢測，以苯甲酰烏頭原堿數(shù)據(jù)計算理論塔板數(shù)大于6 000，分離度大于1.5。對照品溶液及供試品溶液的色譜圖如圖3所示。

圖3 制草烏、偽品與對照品的HPLC 色譜圖

2.2.2 儀器精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液（樣品1#），在1.4色譜條件下，連續(xù)測定6 次，記錄色譜圖，采用Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件（科邁恩科技有限公司）評價，相似度為0.99?？疾焯卣鞣逑鄬ΡＡ魰r間及相對峰面積，以苯甲酰烏頭原堿為參照峰，結(jié)果各特征峰的相對保留時間的相對標準偏差（RSD）小于1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD 小于2%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗

分別于0、2、4、6、8、12、24 h，在1.4 色譜條件下測定同一的供試品（樣品1#）溶液，記錄色譜圖。采用Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件進行評價，相似度為0.99。進一步考察特征峰的相對保留時間及相對峰面積，以苯甲酰烏頭原堿為參照峰，發(fā)現(xiàn)各特征峰的相對保留時間的RSD 小于1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD 小于2%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗

精密稱定同一批樣品（樣品1#）6 份，按2.2.2方法分別制備供試品溶液并測定，記錄色譜圖。采用Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件進行評價，相似度為0.99。進一步考察特征峰的相對保留時間及相對峰面積，以苯甲酰烏頭原堿為參照峰，發(fā)現(xiàn)各特征峰的相對保留時間的RSD 小于1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD 小于2%，表明該方法重復(fù)性好。

2.3 比較分析制草烏特征圖譜與偽品色譜圖

精密稱定不同批次的制草烏偽品（樣品21#～30#），按2.2.2 方法制備供試品溶液，測定并記錄色譜圖如圖4 所示。采用Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件分析采集得到的數(shù)據(jù)，計算特征圖譜與制草烏正、偽品相似度如圖5 所示。結(jié)果表明，制草烏正品和特征圖譜之間的相似度均大于0.90，說明相似度良好；偽品和特征圖譜之間的相似度均小于0.25，可見偽品和特征圖譜差異大，存在顯著不同。建立的制草烏特征圖譜可用于制草烏的鑒別和質(zhì)量控制。

圖4 10 批制草烏偽品準噶爾烏頭HPLC 色譜圖

圖5 制草烏及其偽品相似度分析

2.4 化學(xué)計量學(xué)分析

采用Chempattern 化學(xué)計量學(xué)軟件處理采集的數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)為AIA 格式），對相應(yīng)的色譜峰進行積分，按照樣品的標準化處理峰面積，聚類分析和主成分分析的結(jié)果如圖6 和圖7 所示。

圖6 制草烏及其偽品聚類分析結(jié)果

圖7 制草烏及其偽品主成分分析結(jié)果

由圖6、圖7 可知，兩種方法均能將制草烏及其偽品分成兩組，進而準確地區(qū)分制草烏的正、偽品。

建立的制草烏特征圖譜，20 批制草烏色譜圖與特征圖譜之間的相似度均大于0.90，相似度良好，說明不同批次制草烏成分種類及含量比例相似。而10 批偽品色譜圖與特征圖譜之間相似度均小于0.25，相似度較低，表明偽品與正品的化學(xué)成分存在差異。采用聚類分析和主成分分析均能準確區(qū)分正、偽品，因此，基于特征圖譜可以有效區(qū)分制草烏及其偽品。

2.5 制草烏3 個成分含量測定

樣品按照1.4 方法制備供試品溶液，在1.5 色譜條件下進行測定，采用外標法對20 批正品和10 批偽品中3 種主成分的含量進行計算，結(jié)果分別見表1 和表2。由表1 和表2 可知，20 批正品制草烏和10 批偽品中均含有3 種單酯型生物堿，即苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿，但是制草烏和偽品中3 種成分的比例顯著不同。

表1 20 批正品中3 種成分含量測定結(jié)果 %

表2 10 批偽品中3 種成分含量測定結(jié)果 %

制草烏中含量最高的是苯甲酰新烏頭原堿，苯甲酰新烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為6.80%～13.67%，平均值為10.08%；苯甲酰次烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為0.71%～1.50%，平均值為1.00%。從含量上看，20 批正品制草烏中，有13 批的含量超過《中國藥典》中0.020%～0.070%的規(guī)定，超標1.1～7.9 倍，推測為炮制不規(guī)范所致。

偽品中含量最高的是苯甲酰烏頭原堿，與正品明顯不同。偽品中苯甲酰新烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為0.01%～0.06%，平均值為0.03%；苯甲酰次烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為0.02%～0.05%，平均值為0.03%。由此可見，制草烏正、偽品中3 種主要成分的含量比例差異較大，依據(jù)主要成分的含量比例特征可以鑒別制草烏正、偽品。同時，從含量上看，10 批偽品中3 種單酯型生物堿的總量均高于《中國藥典》中含量0.020%～0.070%的規(guī)定，按最高限度計算，超標4.2～26.1 倍。

實驗結(jié)果表明，制草烏偽品與正品中3 種有效成分的含量比例差異較大，偽品中3 種單酯型生物堿的含量超標嚴重，且制草烏正偽品存在差異化學(xué)成分，若混用偽品，將直接影響制草烏的療效和用藥安全，應(yīng)引起注意。

3 結(jié)語

建立了制草烏的特征圖譜，同時探討了3 種有效成分的含量比例特征，可以準確、快速地鑒別制草烏正、偽品。該方法可同時定性、定量，將為制草烏的質(zhì)量控制提供科學(xué)有力的支持。