徐小杰 王學(xué)穎 周 莉 劉清華① 李 軍①

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 青島 266071;3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266237; 4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京100049)

雌二醇是魚(yú)類卵巢分泌的主要的性類固醇激素之一, 在脊椎動(dòng)物卵子發(fā)生、性別分化、卵黃形成、生理免疫以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)等生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用(Lubzenset al, 2010; McCarthy, 2010; Eicket al, 2011)。雌二醇的合成需要膜細(xì)胞層和顆粒層共同完成。首先膽固醇進(jìn)入到膜細(xì)胞層, 膽固醇被CYP11A1 酶催化后, 孕烯醇酮和孕酮進(jìn)行17a-羥基化, 再分別通過(guò)C21、17-羥基途徑先后得17a-羥基孕酮和雄烯二酮。然后雄烯二酮被轉(zhuǎn)化為雄激素被轉(zhuǎn)運(yùn)到顆粒層中, 在芳香化酶(P450arom)的作用下被轉(zhuǎn)化成雌二醇(Milleret al, 1997; Kagawa, 2013)。

芳香化酶由cyp19基因編碼, 屬于細(xì)胞色素P450家族, 是催化雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的一種關(guān)鍵酶。在硬骨魚(yú)中, 芳香化酶基因存在兩種亞型: P450arom A和450arom B, 分別主要表達(dá)于性腺和腦中, 被稱為性腺芳香化酶和腦芳香化酶(Tchoudakovaet al, 1998)。雌激素需要與分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞核內(nèi)的雌激素受體(estrogen receptor, ER)結(jié)合才能發(fā)揮作用(Woodset al,2009)。在目前的硬骨魚(yú)類的研究中, 人們已經(jīng)證實(shí),雌激素與雌激素受體結(jié)合可以起到促進(jìn)卵黃蛋白原產(chǎn)生的作用, 從而維持卵母細(xì)胞的正常發(fā)育(Flouriotet al, 1996; Sabo-Attwoodet al, 2004; Nelsonet al, 2010)。并且在對(duì)大黃魚(yú)的研究中, Chen 等(2015)推測(cè)ERα 和ERβ1 可能參與卵巢發(fā)育和排卵等過(guò)程。

許 氏 平 鲉(Sebastes schlegelii) 隸 屬 于 鲉 形 目(Scorpaeniformes)、鲉 科(Scorpaenidae)、 平 鲉 屬(Sebastes), 是一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)種, 廣泛分布于中國(guó)、日本和韓國(guó)海域。許氏平 鲉營(yíng)胎生繁殖, 且經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的卵黃積累期和妊娠期, 這一特殊的生殖方式使得它受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Mori 等(2003)、Shi 等(2011)、Kwon 等(2013) 對(duì) 許氏平 鲉卵巢發(fā)育過(guò)程中雌二醇的含量變化進(jìn)行過(guò)一定的研究, 但是他們對(duì)于處于妊娠期的許氏平 鲉的研究較少。本文選取了II、III 至孵化前共7 個(gè)發(fā)育期, 通過(guò)分析cyp19a和Era在許氏平 鲉卵巢上的定位、cyp19a和cyp19bmRNA 在不同卵巢發(fā)育時(shí)期及不同組織中的表達(dá)以及不同發(fā)育期的卵巢中雌二醇含量變化, 分析許氏平 鲉卵巢發(fā)育、卵黃積累及其妊娠過(guò)程中從卵巢組織結(jié)構(gòu)變化、雌激素水平, 芳香化酶及雌激素受體的表達(dá)規(guī)律, 為深入解析許氏平 鲉胎生生殖特性積累資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用許氏平 鲉(Sebastes schlegelii)來(lái)自青島南山市場(chǎng), 從9 月到次年5 月每月購(gòu)買(mǎi); 所用大菱鲆從威海圣航水產(chǎn)科技有限公司獲得, 從3 月到7 月每月采集。取樣之前, 使用麻醉劑(MS-222, Sigma, St.Louis, MO)將所有魚(yú)麻醉, 然后收集每條魚(yú)的腦、心臟、鰓、腎臟、肝臟、脾臟、腸道以及二分之一的卵巢等組織保存在液氮中用于后續(xù)的分子實(shí)驗(yàn)。四分之一的卵巢組織在Bouin’s 液中固定24 h, 然后置換到70%的酒精中保存用于后續(xù)的組織學(xué)觀察; 另外四分之一的卵巢組織在多聚甲醛中固定24 h, 然后置換到70%的酒精中保存用于后續(xù)的原位雜交實(shí)驗(yàn)。除此之外, 從靜脈中抽取血液樣品到抗凝管中, 4 °C 保存24 h 后16 000g離心10 min, 將上清液保存在–80 °C用于后續(xù)的激素測(cè)定。

1.2 RNA 提取和cDNA 合成

將保存在液氮中組織樣品取出, 使用 SPARK easy tissue/cell RNArapid extraction kit (SparkJade,China)試劑盒并參考其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA 的提取。提取后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 并在260 nm 和280 nm 的紫外光譜下測(cè)定濃度, 然后使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 使終濃度統(tǒng)一為1 000 ng/μL。然后稀釋至100 ng/μL, 置于–20 °C 中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 組織學(xué)

固定好的卵巢樣品經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水(70%, 80%,85%, 90%, 95%, 100%)、復(fù)水環(huán)節(jié)被包埋到石蠟中。修整蠟塊后, 用Leica 2235 切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片, 切片厚度為5 μm。然后進(jìn)行蘇木精-伊紅(H.E)染色, 染好色的切片置于NikonENi (Japan)下觀察處于不同發(fā)育期的卵巢的組織形態(tài), 文章中卵母細(xì)胞的卵子發(fā)育過(guò)程參考史丹等(2011)和Grier 等(2009)的研究分為五個(gè)時(shí)期。

1.4 原位雜交

Era和cyp19a的cDNA 序列從本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得。第一輪PCR 擴(kuò)增以稀釋后的濃度為100 ng/μL 卵巢組織的cDNA 作為模板, 上下游分別使用F 和R 引物(Era-F/R,cyp19a-F/R)。第二輪擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板, 上下游分別使用F 和R-T7 引物(Era-F/ISH-RT7,cyp19a-F/ISH-RT7), 得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化后, 用DIG RNA Labeling Kit (Roche,Mannheim, Germany)合成探針, 進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)。表1 中列出了合成探針過(guò)程中所用的引物。

表1 引物名稱及序列Tab.1 The names of the primers and the sequences

1.5 半定量(RT-PCR)

以采集到的體節(jié)期的腦、心臟、鰓、腎臟、肝臟、脾臟、腸道和卵巢以及整個(gè)發(fā)育期的卵巢樣品分別作為模板, 針對(duì)兩個(gè)基因設(shè)計(jì)不同的引物(cyp19a-F/R,cyp19b-F/R), 并選用18S 作為內(nèi)參照進(jìn)行一同進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 所用引物同樣列在表1 中。PCR 擴(kuò)增體系為: 模板cDNA 0.5 μL、KOD ONE 酶12.5 μL、上下游引物各0.75 μL、無(wú)菌水10.5 μL。反應(yīng)程序: 98 °C反應(yīng)10 s, 68 °C 反應(yīng)10 s, 35 循環(huán)。

1.6 激素測(cè)定

將采集的血清樣品從–80 °C 冰箱中取出, 按照Iodine [125I] Radioimmunoassay (RIA) kits (Beijing,China) 的 說(shuō)明書(shū)對(duì)許氏平 鲉雌激素的含量進(jìn)行測(cè)定。該方法與雌激素的結(jié)合率高, 對(duì)其他甾體的交叉反應(yīng)性低, 對(duì)大多數(shù)循環(huán)甾體的交叉反應(yīng)性小于0.1%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Spss22.0 中的Duncan’s 法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析, 當(dāng)P<0.05 時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 許氏平鲉卵巢在整個(gè)發(fā)育期的形態(tài)變化

見(jiàn)圖1。 許氏平 鲉的卵巢中含有豐富的間質(zhì)細(xì)胞,當(dāng)卵巢發(fā)育至II 期的時(shí)候, 卵巢內(nèi)以2 時(shí)初級(jí)相卵母細(xì)胞為主。2 時(shí)相初級(jí)卵母細(xì)胞體積較小且形狀不規(guī)則, 呈多邊形, 胞質(zhì)呈強(qiáng)嗜堿性, 核質(zhì)均勻且著色較淺。此時(shí)的卵母細(xì)胞沒(méi)有發(fā)育出清晰的濾泡層結(jié)構(gòu),細(xì)胞外僅有一層濾泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)。一般在11 月的時(shí)候,許氏平 鲉的卵巢發(fā)育至III 期, 此時(shí)卵巢內(nèi)以3 時(shí)相卵母細(xì)胞為主。3 時(shí)相卵母細(xì)胞被生殖上皮包圍, 呈圓球形, 濾泡細(xì)胞發(fā)展成2 層。濾泡細(xì)胞包繞著卵母細(xì)胞, 形成獨(dú)立的卵泡結(jié)構(gòu)。卵母細(xì)胞皮質(zhì)部分出現(xiàn)體積大于皮層小泡的油球, 以后油球數(shù)目逐漸增多。雄魚(yú)與雌魚(yú)的交配就發(fā)生在這一階段, 交配后, 精子進(jìn)入到雌魚(yú)的卵巢腔內(nèi)。當(dāng)卵巢發(fā)育到IV 期的時(shí)候,一般是1 月, 卵巢內(nèi)充滿4 時(shí)相卵母細(xì)胞。4 時(shí)相卵母細(xì)胞較3 時(shí)相卵母細(xì)胞體積進(jìn)一步增大, 卵黃顆粒數(shù)量迅速增多, 卵黃顆粒體積迅速增大, 濾泡層被壓縮變窄。當(dāng)卵巢內(nèi)以5 時(shí)相卵母細(xì)胞為主時(shí), 卵巢發(fā)育處于V 期(史丹等, 2011)。經(jīng)過(guò)了漫長(zhǎng)的卵黃積累過(guò)程, 在這一時(shí)期, 卵母細(xì)胞已充分發(fā)育成熟, 細(xì)胞內(nèi)充滿成熟卵黃顆粒, 部分卵黃顆粒開(kāi)始融合, 濾泡層破裂。卵子受精后, 顆粒層脫離透明帶(ZP), 與周圍的膜細(xì)胞層混合, 形成屏障。隨后, 它們迅速遷移、侵入周圍組織并迅速擴(kuò)張, 形成濾泡胎盤(pán)以支持胚胎發(fā)育。在妊娠期早期, 隨著胚胎的發(fā)育, 濾泡胎盤(pán)進(jìn)一步發(fā)育和擴(kuò)張。當(dāng)胚胎發(fā)育至囊胚期的時(shí)候, 胚胎周圍包繞著豐富的呈折疊狀的濾泡胎盤(pán)。隨著胚胎的繼續(xù)發(fā)育, 濾泡胎盤(pán)逐漸變得疏松。當(dāng)胚胎發(fā)育到體節(jié)期的時(shí)候, 濾泡胎盤(pán)結(jié)構(gòu)較囊胚期疏松, 到了孵化前期, 視野內(nèi)只能觀察到極少的濾泡胎盤(pán)的存在。

圖1 許氏平 鲉卵巢在整個(gè)發(fā)育期的組織學(xué)觀察Fig.1 Histology of the black rockfish ovary development

2.2 cyp19a 和Era 在許氏平 鲉卵巢中的定位

當(dāng)許氏平 鲉的卵巢發(fā)育到III 期和IV 期的時(shí)候,cyp19a在濾泡層上有信號(hào), 并且特異的表達(dá)在顆粒細(xì)胞上(圖2a, 2b)。在V 期卵巢中可以觀察到,cyp19a的信號(hào)變得極其微弱(圖2c), 在囊胚期則觀察不到信號(hào)(圖2d)。Era在III 期和IV 期卵巢中檢測(cè)不到信號(hào)(圖2e, 2f), 當(dāng)卵巢發(fā)育至V 期的時(shí)候, 在5 時(shí)相卵母細(xì)胞的濾泡層上可以觀察到非常明顯的信號(hào), 除此之外,濾泡層外面的基質(zhì)細(xì)胞也可以檢測(cè)到信號(hào)表達(dá)(圖2g)。在囊胚期,Era的陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)在濾泡胎盤(pán)上并且依然非常明顯(圖2h)。圖2(a1)為正義探針的雜交結(jié)果。

圖2 cyp19a 和Era 的原位雜交結(jié)果Fig.2 In situ hybridization results of cyp19a and Era

2.3 cyp19a 和cyp19b mRNA 在不同組織中及不同卵巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

見(jiàn)圖3。在同一條魚(yú)的不同組織中,cyp19a僅在卵巢和腦中有表達(dá), 且在卵巢中的表達(dá)量明顯高于腦。cyp19b在卵巢、脾臟、腦和肝臟中都有表達(dá), 其中腦的表達(dá)量最高, 卵巢、脾臟和肝臟中微弱表達(dá)。在許氏平 鲉整個(gè)卵巢發(fā)育時(shí)期,cyp19a在III 期、IV期、V 期、囊胚期和體節(jié)期均有表達(dá), III 期、IV 期和體節(jié)期的表達(dá)要強(qiáng)于V 期和囊胚期, 孵化前期沒(méi)有表達(dá)。cyp19b在整個(gè)卵巢發(fā)育過(guò)程中只在III 期、IV期和體節(jié)期有表達(dá), 且體節(jié)期的表達(dá)強(qiáng)于IV 期, III期的條帶極其微弱, 在V 期、囊胚期和孵化前期沒(méi)有表達(dá)。并且整體來(lái)看, 在同一時(shí)期,cyp19a的表達(dá)要強(qiáng)于cyp19b。

圖3 cyp19a 和cyp19b 的表達(dá)情況Fig.3 The expression of cyp19a and cyp19b

2.4 不同發(fā)育期的卵巢中雌二醇含量變化

見(jiàn)圖4。在II 期和III 期卵巢中, 雌二醇含量處于較低的水平。當(dāng)許氏平鲉 雌魚(yú)卵巢發(fā)育至IV 期的時(shí)候,雌二醇含量極速升高, 達(dá)到峰值。此后出現(xiàn)回落, 在體節(jié)期再次上升, 回歸到峰值水平, IV 期和體節(jié)期時(shí)許氏平 鲉體內(nèi)的雌二醇含量顯著高于其他時(shí)期。整體看來(lái), 許氏平 鲉妊娠期體內(nèi)的雌二醇的含量保持在較高的水平。大菱鲆在卵子發(fā)生過(guò)程中體內(nèi)的雌二醇含量變化趨勢(shì)與許氏平 鲉基本一致, 從III 期發(fā)育到IV 期的時(shí)候, 雌二醇含量極速上升, 然后在V 期出現(xiàn)回落。

圖4 不同發(fā)育期的卵巢中雌二醇含量變化Fig.4 Changes of estradiol content in ovaries at different developmental stages

3 討論

許氏平 鲉雌魚(yú)在卵子發(fā)生過(guò)程中的組織學(xué)形態(tài)與卵生魚(yú)類相似(朱亮華等, 2018)。當(dāng)卵巢發(fā)育至II期的時(shí)候, 卵巢內(nèi)以2 時(shí)初級(jí)相卵母細(xì)胞為主。2 時(shí)相初級(jí)卵母細(xì)胞體積較小且形狀不規(guī)則, 呈多邊形,胞質(zhì)呈強(qiáng)嗜堿性, 核質(zhì)均勻且著色較淺。此時(shí)的卵母細(xì)胞沒(méi)有發(fā)育出清晰的濾泡層結(jié)構(gòu), 細(xì)胞外僅有一層濾泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)。當(dāng)卵巢發(fā)育至III 期的時(shí)候, 卵巢內(nèi)以3 時(shí)相卵母細(xì)胞為主。3 時(shí)相卵母細(xì)胞被生殖上皮包圍, 呈圓球形, 濾泡細(xì)胞發(fā)展成2 層。卵母細(xì)胞皮質(zhì)部分出現(xiàn)體積大于皮層小泡的油球, 以后油球數(shù)目逐漸增多。當(dāng)卵巢發(fā)育到IV 期的時(shí)候, 卵巢內(nèi)充滿4 時(shí)相卵母細(xì)胞。4 時(shí)相卵母細(xì)胞較3 時(shí)相卵母細(xì)胞體積進(jìn)一步增大, 卵黃顆粒數(shù)量迅速增多、體積迅速增大, 濾泡層被壓縮變窄。當(dāng)卵巢發(fā)育至V 期時(shí),卵母細(xì)胞已充分發(fā)育成熟, 細(xì)胞內(nèi)充滿成熟卵黃顆粒,部分卵黃顆粒開(kāi)始融合。

但是許氏平 鲉卵子發(fā)生過(guò)程與卵生魚(yú)類不同的地方在于, 當(dāng)卵巢發(fā)育到III 期的時(shí)候, 濾泡層發(fā)育為2 層, 生殖上皮包繞住了3 時(shí)相卵母細(xì)胞, 形成了許多獨(dú)立的卵泡。雌魚(yú)和雄魚(yú)在這一時(shí)期交配, 交配后精子散落的分布在卵巢腔內(nèi)。獨(dú)立的卵泡通過(guò)莖狀結(jié)構(gòu)分別與基質(zhì)相連, 使得每個(gè)卵泡與精子接觸的概率大致相同, 并且卵泡能夠從基質(zhì)以及包繞在濾泡層上的血管中直接獲得營(yíng)養(yǎng), 減少了卵子之間的競(jìng)爭(zhēng), 從而保證受精和營(yíng)養(yǎng)吸收效率。

受精后, 我們?cè)诮M織學(xué)上并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)胚胎外的2細(xì)胞結(jié)構(gòu), 說(shuō)明濾泡層在受精前或者受精過(guò)程中就已經(jīng)破裂, 這與Bretschneider 等(1947)的研究結(jié)果一致。此后, 濾泡層迅速增殖并侵入周圍的結(jié)締組織,變得高度肥大, 廣泛折疊和高度血管化, 并在囊胚期迅速形成濾泡胎盤(pán)。該結(jié)構(gòu)在形態(tài)上非常類似于哺乳動(dòng)物絨膜尿囊胎盤(pán)的一部分(Groveet al, 1994;Laksanawimolet al, 2006; Kwanet al, 2015 )。

在許氏平 鲉卵子發(fā)生的過(guò)程中, 血漿中雌二醇的含量不斷增加, 這與史丹等(2011)的研究結(jié)果一致。并且我們發(fā)現(xiàn), 當(dāng)卵巢發(fā)育到IV 期的時(shí)候, 許氏平 鲉體內(nèi)的雌二醇含量顯著高于其他時(shí)期, 達(dá)到峰值。由于Shi 等(2011)將IV 期和V 期的雌二醇含量合并到一起, 所以并沒(méi)有非常突出的高于II 期和III期, 但在整個(gè)卵子發(fā)育期仍然呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 進(jìn)一步印證了雌二醇具有促進(jìn)卵黃蛋白原產(chǎn)生從而促進(jìn)卵巢發(fā)育的作用。這一結(jié)果與一些卵生魚(yú)類, 如: 斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides) (趙會(huì)宏等, 2003)、赤點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelus akaara) (劉付永忠, 2004)、雙棘黃姑魚(yú)(Nibea diacanthus) (沈卓坤等, 2007)等研究結(jié)果相同。在胚胎發(fā)育的過(guò)程中, 當(dāng)胚胎發(fā)育至體節(jié)期的時(shí)候, 血漿中雌二醇的含量再次上升達(dá)到一個(gè)小高峰, 同時(shí)cyp19a、cyp19b的表達(dá)也高于囊胚期, 我們推測(cè)這可能說(shuō)明雌二醇對(duì)母體維持妊娠具有一定的支撐作用。

雌激素必須與雌激素受體結(jié)合才能發(fā)揮作用,我們通過(guò)追蹤Era在許氏平 鲉卵巢上的定位發(fā)現(xiàn), 在III 期和IV 期卵巢上沒(méi)有檢測(cè)到Era的信號(hào)。當(dāng)卵巢發(fā)育到V 期的時(shí)候, 在濾泡層和基質(zhì)中都出現(xiàn)了強(qiáng)烈的陽(yáng)性信號(hào), 并且在囊胚期的時(shí)候信號(hào)依然非常明顯。硬骨魚(yú)類和哺乳類ERa在DNA 結(jié)合區(qū)和配體結(jié)合區(qū)高度保守, 這兩個(gè)功能域的可相似性分別達(dá)到90%和60%。在哺乳動(dòng)物中,ERa主要在子宮、乳腺、卵巢以及輸卵管中表達(dá)(Couseet al, 1997), 因此我們推測(cè)許氏平 鲉的濾泡胎盤(pán)可能與哺乳動(dòng)物的胎盤(pán)存在某些功能上的相似性。

cyp19a在雌性許氏平 鲉中僅在卵巢和腦中有表達(dá), 且在卵巢中的表達(dá)量高于腦。這與Wen 等(2014)的研究結(jié)果基本相似, 他們認(rèn)為cyp19a僅在許氏平鲉的卵巢中有表達(dá), 這可能與所采用的樣品處于不同的發(fā)育時(shí)期或者實(shí)驗(yàn)時(shí)所用的PCR 循環(huán)數(shù)不同有關(guān)。這與金魚(yú)(Carassius auratus) (Tchoudakovaet al,1998)、斑馬魚(yú)(Denio rerio) (Kishidaet al, 2001)在其他外周組織也有表達(dá)的研究結(jié)果也有所不同, 這些差異可能與不同魚(yú)類之間物種差異以及發(fā)育時(shí)期的不同有關(guān)。但無(wú)論在哪種魚(yú)類中,cyp19a在卵巢中的表達(dá)量都是最高的, 這也說(shuō)明了cyp19a在維持卵巢發(fā)育方面具有重要的作用。cyp19b在卵巢、脾臟、腦和肝臟中都有表達(dá), 其中腦的表達(dá)量最高, 卵巢、脾臟和肝臟中微弱表達(dá), 這與楊艷平等(2012)的研究結(jié)果基本相似, 他們認(rèn)為cyp19b在腦、卵巢、脾臟和頭腎中表達(dá), 這可能與樣品處于不同的發(fā)育時(shí)期有關(guān)。我們的研究結(jié)果與三斑石斑魚(yú)(Epinephelus trimaculatus)(陳華譜等, 2012)的結(jié)果相同。在卵巢發(fā)育的不同時(shí)期, 在許氏平 鲉整個(gè)卵巢發(fā)育時(shí)期,cyp19a在III 期、IV 期、V 期、囊胚期和體節(jié)期均有表達(dá), III 期、IV 期和體節(jié)期的表達(dá)要強(qiáng)于V 期和囊胚期, 孵化前期沒(méi)有表達(dá)。這與Wen 等(2014)等的結(jié)果一致, 在他們的研究結(jié)果中, 從7 月到9 月、11 月次年1 月以及3 月,cyp19a的表達(dá)量基本相同, 5 月時(shí)表達(dá)量有所下降。我們對(duì)于發(fā)育時(shí)期的劃分要更為清晰, 并且對(duì)妊娠時(shí)期的許氏平 鲉卵巢中cyp19a的表達(dá)量進(jìn)行了補(bǔ)充。cyp19b在整個(gè)卵巢發(fā)育過(guò)程中只在III 期、IV 期和體節(jié)期有表達(dá), 且體節(jié)期的表達(dá)強(qiáng)于IV 期, III 期的條帶極其微弱。在V 期、囊胚期和孵化前期沒(méi)有表達(dá)。這與楊艷平等(2012)和Kwon 等(2013)的研究結(jié)果基本一致, 楊艷平等(2012)只研究了卵子發(fā)生期和退化期, 在卵子發(fā)生期cyp19b只在III 期和IV 期表達(dá); Kwon 等(2013)的研究結(jié)果顯示cyp19b在卵黃積累期和妊娠期都有表達(dá), 這同樣與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合, 只是我們對(duì)卵黃積累期和妊娠期進(jìn)行了進(jìn)一步的細(xì)化, 發(fā)現(xiàn)cyp19b在整個(gè)卵巢發(fā)育過(guò)程中只在III 期、IV 期和體節(jié)期有表達(dá)。我們認(rèn)為cyp19b在體節(jié)期的高表達(dá)或許是作為雌二醇來(lái)源的一個(gè)補(bǔ)充,cyp19a和cyp19b在體節(jié)期的高表達(dá)共同導(dǎo)致了雌二醇在處于體節(jié)期的許氏平 鲉體內(nèi)有較高含量這一結(jié)果, 由此我們推測(cè)cyp19b對(duì)許氏平卵巢的發(fā)育同樣發(fā)揮著重要的作用。

4 結(jié)論

本文分析了與雌二醇合成及作用密切相關(guān)的cyp19a和Era在許氏平 鲉卵巢上的定位, 芳香化酶cyp19a、cyp19bmRNA 在不同組織中和不同卵巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá), 以及不同發(fā)育期的卵巢中雌二醇含量變化。首先, 在V 期卵巢的濾泡層、基質(zhì)和囊胚期的濾泡胎盤(pán)上都檢測(cè)到了強(qiáng)烈的Era的信號(hào)。其次,cyp19a和cyp19b在卵巢中均有表達(dá)且在不同的卵巢發(fā)育期表達(dá)量不同。在卵黃積累的過(guò)程中,cyp19a和cyp19b在IV 期的表達(dá)量最高, 在妊娠過(guò)程中則是體節(jié)期表達(dá)量最高。除此之外, 在卵巢發(fā)育的過(guò)程中,許氏平 鲉體內(nèi)雌二醇含量的峰值分別出現(xiàn)在IV 期和體節(jié)期。這些結(jié)果說(shuō)明雌二醇在胎生魚(yú)類卵子發(fā)生及妊娠過(guò)程中均起到非常重要的作用。本文從雌激素的角度出發(fā), 結(jié)合許氏平 鲉卵巢自身的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 就許氏平 鲉卵巢發(fā)育及其胎生的生殖方式提供了新的解讀, 為許氏平 鲉胎生這一特殊的生殖方式的研究提供了新的思路。