惠治兵 畢江濤 李文兵 劉 鵬 孫 權(quán)

(1.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學環(huán)境工程研究院，寧夏 銀川 750021)

我國是世界上馬鈴薯淀粉產(chǎn)量最大的國家，年產(chǎn)量約占世界的85.9%，馬鈴薯淀粉廢水具有高COD、高濁度、高泡沫且易產(chǎn)生惡臭的特點，未經(jīng)處理的淀粉廢水排放后對環(huán)境造成了較大的影響[1]，不僅引起水體微生物的大量繁衍，消耗水中的溶解氧導致水生生物缺氧死亡，而且其自然發(fā)酵易產(chǎn)生H2S、NH3、吲哚等氣體污染物，會給生態(tài)環(huán)境造成較大壓力[2-3]。國外較多企業(yè)都嘗試用化學、物理的方法來處理馬鈴薯淀粉廢水，但受設備投入及運行成本的制約，應用普及不太理想。研究顯示1 t淀粉廢水中，含有約2.37 kg糖、0.26 kg氮、0.83 kg含硫蛋白物質(zhì)和1.16 kg膠類，其有效成分適宜微生物生長，因此，利用微生物處理馬鈴薯淀粉廢水具有一定的應用前景[4-6]。AGORINYA[7]從馬鈴薯淀粉廢水的活性污泥中分離得到具有COD降解功能的微生物，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)優(yōu)化的單菌株對COD去除能力較弱，所以對高效功能菌株的篩選和其降解條件優(yōu)化迫在眉睫。

本研究以寧夏某馬鈴薯淀粉加工廠的馬鈴薯淀粉廢水為菌源，從中篩選目標菌株，并對COD的降解能力進行優(yōu)化，以期為馬鈴薯淀粉廢水的生物法處理提供菌種資源和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源

采樣點位于寧夏某馬鈴薯淀粉加工廠，馬鈴薯淀粉生產(chǎn)能力為2萬t/a，產(chǎn)生馬鈴薯淀粉廢水約10萬t/a，COD的初始值為22 987 mg/L，研究所需菌株篩選自該廢水。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：將1 L的馬鈴薯淀粉廢水pH調(diào)節(jié)至7.0，添加酵母粉1 g/L，蛋白胨1 g/L，121 ℃滅菌20 min[8]53。

分離培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉l5 g/L，牛肉浸膏5 g/L，瓊脂20 g/L，滅菌馬鈴薯淀粉廢水1 L，pH為7.0。

溶菌肉湯(LB)液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉5 g/L，蒸餾水1 L，pH為7.0。

營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L，pH為7.0。

1.2 方 法

1.2.1 菌株富集

將取樣廢水以10.0%(體積分數(shù)，下同)的接種量接種于富集培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)2 d，取10%富集物重新接種于新的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 d，重復3次獲得富集菌群[8]53。

1.2.2 菌株的分離與純化

從上述富集培養(yǎng)液中取1 mL于滅菌試管并加入9 mL無菌水稀釋后，依次重復稀釋制備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍數(shù)的稀釋液，均勻涂布在分離培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h之后，挑選長勢良好、形態(tài)不同的單菌落，采用平板劃線法純化3～4次，于-20 ℃冰箱保存[9]。

1.2.3 功能菌株的復篩

取純化好的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，在28 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)3 d后，6 000 r/min離心10 min獲得高密度菌體，并用無菌水將其調(diào)節(jié)為600 nm波長處的吸光值(OD600)為1的菌懸液，以2%的接種量接入供試水體中，pH為7.0，溫度28 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，每天上午10點測定水體中的COD，COD采用重鉻酸鉀法測定[10]，每個處理重復3次，同時設空白對照(CK)。

1.2.4 菌株形態(tài)學和生理生化鑒定

菌株形態(tài)學鑒定參考《伯杰細菌鑒定手冊》。生理生化測定項目主要包括甲基紅實驗、乙酰甲基甲醇(V-P)實驗、氧化酶實驗、淀粉水解實驗、硫化氫產(chǎn)氣實驗、α-乳糖實驗、明膠水解實驗、葡萄糖氧化酶實驗、檸檬酸鹽實驗和脲酶實驗，以上測定均參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行。

1.2.5 分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關系

將純化好的菌株接種于斜面，進行16S rDNA序列測定，正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，對菌株進行16S擴增。多聚酶鏈式反應(PCR)擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃ 90 s，32個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min[11]。菌株測定序列提交NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov)GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為MT105951。通過NCBI在線BLAST系統(tǒng)與數(shù)據(jù)庫中16S rDNA序列進行比對，然后選取與目標菌株同源性較強的菌株序列，通過MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12]。

1.2.6 菌株生長曲線的繪制

將保存的斜面菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min的條件下活化培養(yǎng)，活化后將菌液以6 000 r/min離心，將菌體用無菌水稀釋至OD600為1的種子液，取菌株種子液，按5.0%接種量轉(zhuǎn)接至盛有滅菌后的LB液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，混合均勻后分別取5 mL混合液接入已標記好培養(yǎng)時間的20支試管(直徑15 mm、高度150 mm)中，硅膠塞封口，設置3次重復，以不加菌的LB液體培養(yǎng)基作為空白。將已接種的試管于28 ℃、150 r/min的條件下進行培養(yǎng)，按標記的培養(yǎng)時間取出試管，測定其OD600，以空白作參比。以測得3次重復的OD600平均值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制生長曲線[13]。

1.2.7 菌株發(fā)酵單因素條件優(yōu)化

(1) pH對COD的降解影響：溫度為28 ℃，接種量為2.0%，于150 r/min的條件下恒溫水浴振蕩培養(yǎng)3 d，分別測定3 d內(nèi)pH在6.0、6.5、7.0、7.5、8.0條件下馬鈴薯淀粉廢水COD的降解情況，以確定最佳發(fā)酵pH，每組3個重復，下同。

(2) 溫度對COD的降解影響：pH為7.0，接種量為2.0%時，其他條件不變的情況下，分別測定在15、20、25、30、35 ℃水平下的COD去除效果，以確定最佳發(fā)酵溫度。

(3) 接種量對COD的降解影響：pH為7.0，溫度為28 ℃時，其他條件不變的情況下，分別測定接種量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%水平下的COD降解情況，以確定最佳接種量[14]。

1.2.8 發(fā)酵條件響應面優(yōu)化

在單因素實驗結(jié)果基礎上，采用3因素3水平的Box-Behnken響應面實驗設計法，以pH、時間和接種量為自變量，以COD為響應值進行優(yōu)化。采用Design-Expert 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析[15]，Box-Benhnken實驗因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 功能菌株的篩選

從馬鈴薯淀粉廢水中經(jīng)富集、分離、純化和篩選后共得到3株具有降解COD功能的菌株，編號分別為PWF015、PWF016、PWF017。3株供試菌株對淀粉廢水COD的降解結(jié)果見表2，經(jīng)3菌株分別處理3 d后，不同處理下的馬鈴薯淀粉廢水的COD降解率與CK相比存在顯著差異(P<0.05)。處理第1天，菌株PWF015的COD降解能力與CK相比差異最為顯著，菌株PWF017次之，而菌株PWF016差異不顯著。綜合3 d的結(jié)果可以得出：菌株PWF015對馬鈴薯淀粉廢水中的COD降解效果最顯著(P<0.05)，其COD降解率為60.38%，說明在相同發(fā)酵條件下，菌株PWF015對淀粉廢水的COD降解能力要強于另外兩株菌，因此后續(xù)分析均以此菌株為基礎。

表2 不同菌株處理間效果比較1)

注:1)不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)，圖5至圖7同。

2.2 菌株形態(tài)學和生理生化鑒定結(jié)果

選取菌株PWF015于NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h，然后選取有明顯單菌落的培養(yǎng)基進行菌株形態(tài)觀察。由圖1可以看出，菌落隆起，呈圓形，表面褶皺粗糙，呈白色。菌株革蘭氏染色結(jié)果為陽性，呈桿狀(見圖2)。菌株PWF015生理生化鑒定結(jié)果見表3，可以看出菌株具有降解淀粉、α-乳糖和葡萄糖等功能，對照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步鑒定該菌屬于芽孢桿菌屬(BacillusCohn)。

圖1 菌株PWF015菌落圖Fig.1 Colony diagram of strain PWF015

圖2 菌株PWF015革蘭氏染色鏡檢圖Fig.2 Gram staining microscopy of strain PWF015

表3 菌株PWF015的生理生化特征1)

2.3 分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關系結(jié)果

測序序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，確定該菌為芽孢桿菌屬。選取與目標菌株相似性較高的9株菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3，由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出：菌株PWF015與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)KU161297.1在同一分支，說明該菌與解淀粉芽孢桿菌親緣關系最近，因此可以判斷該菌為解淀粉芽孢桿菌[16]。

圖3 菌株PWF015的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain PWF015

2.4 菌株生長曲線

按標記的培養(yǎng)時間依次從冰箱取出試管，測量菌液的OD600，結(jié)果見圖4。在0～48 h，OD600呈上升趨勢，在48 h出現(xiàn)峰值，而在48 h之后逐漸穩(wěn)定并開始呈下降趨勢，說明菌株在0～48 h處于生長繁殖期且生長較快，而在48 h達生長高峰期，之后逐漸進入衰退期。

圖4 菌株PWF015的生長曲線Fig.4 Growth curve of strain PWF015

2.5 菌株發(fā)酵條件單因素實驗

pH對COD降解的影響見圖5。當pH為8.0時，菌株對COD的降解效果最好(P<0.05)，且優(yōu)于其他處理，COD降解率為64.27%，由此可以看出，堿性條件有利于菌株對COD的降解。

圖5 不同pH處理下菌株對COD的降解 Fig.5 Degradation of COD by strain under different pH treatment

溫度對COD降解的影響見圖6。隨著溫度上升菌株對COD降解能力提升較顯著(P<0.05)，菌株的活性逐漸增強，對COD的降解效果隨之提升，當溫度上升為30 ℃時,COD降解率為65.89%，達到最高且差異顯著(P<0.05)，而溫度上升至35 ℃卻對菌株的降解能力產(chǎn)生了抑制效果。

圖6 不同溫度處理下菌株對COD的降解Fig.6 Degradation of COD by strain under different temperature treatment

接種量對COD降解的影響見圖7。接種量為1.5%時，菌株對廢水COD降解能力最好(P<0.05)，COD降解率為55.92%，達到最高，接種量對菌株的降解能力有一定影響，菌株過多反而會起到抑制作用。綜上所述，當pH為8.0，接種量為1.5%，溫度為30 ℃時菌株對馬鈴薯淀粉廢水的COD降解效果最佳。

圖7 不同接種量下菌株對COD的降解Fig.7 Degradation of COD by strain under different dosage treatment

2.6 菌株發(fā)酵條件響應面優(yōu)化

2.6.1 Box-Benhnken實驗設計及結(jié)果

為了進一步優(yōu)化菌株PWF015對COD降解的條件，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取pH、溫度和接種量作為影響因素，以馬鈴薯淀粉廢水COD降解率作為響應值進行Box-Benhnken實驗。實驗設計及結(jié)果見表4。

表4 Box-Benhnken實驗設計及結(jié)果

2.6.2 二次回歸方程擬合與方差分析

對實驗數(shù)據(jù)進行二次回歸方程擬合，得到COD降解率(Y，%)與pH(A)、溫度(B，℃)和接種量(C，%)的二次回歸方程為：

Y=71.54+0.99A-0.49B-0.72C+0.12AB+1.05AC-0.05BC-3.21A2-6.41B2-2.78C2

(1)

COD降解率的F值為12.82，P<0.01，表明效應極顯著，R2=0.943 3，說明方程能夠解釋94.33%的COD降解率變化；變異系數(shù)<10%，表明實驗的可信度和精確度高[17]。

2.6.3 兩因素交互作用對COD的影響

由響應面分析結(jié)果可知：隨著pH和溫度的上升，COD降解率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當pH為8.0，溫度為30 ℃時，響應面圖存在峰值，廢水COD的降解率為71.65%。當pH為8.0，接種量為2.0%時響應面圖存在峰值，即COD降解率達到最大。溫度為30 ℃，接種量為2.0%時廢水COD降解率達到最大。分析可知，pH/溫度和溫度/接種量對COD降解率影響的交互作用較為顯著，而pH/接種量的交互作用不顯著。結(jié)合等高線和響應面可以得出：溫度和pH對菌株降解COD的能力影響較大，接種量次之。

2.6.4 最優(yōu)預測響應結(jié)果

如表5所示，當pH為8.07，溫度為29.81 ℃，接種量為1.95%時達到最大理論優(yōu)化值，COD降解率為71.65%，實驗優(yōu)化效果較顯著。優(yōu)化前COD降解率為60.38%，這與劉清兵[18]在蝦養(yǎng)殖廢水中分離得到COD降解率為55%的解淀粉芽孢桿菌相比，降解能力有些許優(yōu)勢，但實際應用中略有不足，原因可能是發(fā)酵條件對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生α-淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶的能力和其產(chǎn)生酶的活性影響較大[19]，也可能是本實驗所用馬鈴薯淀粉廢水COD過高，加上其成分復雜，菌株的降解能力未能全部發(fā)揮出來，需進一步優(yōu)化。

表5 響應面最優(yōu)預測值

經(jīng)響應面優(yōu)化后，菌株對COD的降解率達到71.65%，較優(yōu)化前提高了11.27百分點，總體來看，本實驗所篩的菌株和發(fā)酵條件優(yōu)化所用的響應面法，對解決馬鈴薯淀粉廢水問題提供了一定幫助，說明了本實驗研究成果的可取性。

2.6.5 響應結(jié)果驗證

以響應面優(yōu)化所得的理論條件進行驗證實驗，設3次重復，發(fā)酵后所得COD平均降解率為71.46%，與模型預測值僅相差0.19百分點，說明響應面法提供的模型較真實地擬合了實際情況，因此可以得出菌株PWF015在處理馬鈴薯淀粉廢水時的最佳發(fā)酵條件是pH為8.07，溫度為29.81 ℃，接種量為1.95%。因馬鈴薯淀粉廢水含有大量的糖類、蛋白質(zhì)、纖維素等有機營養(yǎng)物質(zhì)[20]，為制作微生物菌劑和微生物肥料提供了良好的載體，而本實驗分離的解淀粉芽孢桿菌具有較強的COD降解能力，可以作為菌種資源，為后續(xù)的菌株復配實驗和相關產(chǎn)品研發(fā)打下了一定基礎。

3 結(jié) 論

(1) 從馬鈴薯淀粉加工廢水中篩選并分離得到一株具有COD降解效果的菌株，通過對該菌株形態(tài)學觀察、生理生化實驗和16S rDNA基因鑒定，確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。

(2) 經(jīng)單因素實驗優(yōu)化后，結(jié)果表明當pH為8.0，溫度為30 ℃，接種量為1.5%時菌株對馬鈴薯淀粉廢水的COD降解效果最佳。響應面優(yōu)化結(jié)果表明pH、溫度、接種量分別為8.07、29.81 ℃、1.95%時，COD降解率達到了71.65%，較優(yōu)化前提高了11.27百分點。