馬世江，沈長波，劉杰，譚軍

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

世界衛(wèi)生組織2014年發(fā)布的《世界衛(wèi)生統(tǒng)計報告》顯示，全球每年約有670萬人死于卒中，卒中是世界第二大致死原因，也是永久性致殘的主要原因之一。其中，缺血性卒中占全部卒中事件中的80%～85%［1］。持續(xù)的缺血會導致腦組織損傷和壞死，恢復血液供應雖然可以挽救缺血引起的可逆性損傷，但缺血/再灌注的過程同時也會引起腦組織和細胞的額外損傷，這種損傷是由一系列復雜的病理、生理因素導致的［1－2］。目前，能有效治療卒中的藥物很少，尋找新的治療方法勢在必行［3］，開發(fā)新的神經保護藥物對于有效治療缺血性損傷具有重要意義。

辣椒素（Capsaicin，CAP）是一種酚類化合物（8－methyl－N－vanillyl－6－nonenamide），能選擇性地激活無髓鞘C 纖維，已廣泛應用于疼痛的研究和治療中［4］。CAP 可以限制能量攝入，增加能量消耗，誘導胰島素分泌，降低血壓，減少脂質儲存和預防動脈粥樣硬化病變。此外，CAP還有抗腫瘤活性，能減少過敏性氣道炎癥和緩解神經源性膀胱癥狀等作用［5］。

近年來，越來越多的研究表明，CAP對心肌的缺血再灌注（I/R）損傷具有保護作用。在大鼠心臟I/R 模型中，CAP 預處理可顯著降低心肌損傷［6－8］。另外，又有積累的證據表明CAP 具有神經保護作用，CAP 可預防哇巴因誘導的大腦興奮性毒性、蒙古沙鼠全腦缺血、N－甲基－D－天冬氨酸（NMDA）誘導的視網膜神經節(jié)細胞丟失以及谷氨酸誘導的皮質神經元損傷等［9－12］。這些研究進一步擴展了CAP 的潛在臨床應用。然而，目前對于CAP 神經保護作用的潛在機制研究卻很少。在本實驗中，筆者通過使用體外神經元培養(yǎng)，檢測CAP 對神經元I/R 損傷的直接作用，并對其潛在的分子機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

辣椒素（Sigma 公司）；尼莫地平注射液（青島金峰制藥有限公司）；L－NAME，LY294002（Sigma 公司）；MTT（北京索萊寶科技有限公司）；Hoechst 33342（碧云天生物技術有限公司）；LDH檢測試劑盒、Caspase－3和Caspase－9活性檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；PrimeScript?RT reagent Kitwith gDNA Eraser 反轉錄試劑盒，TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ實時熒光定量試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；SpectraMax M3 多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；LighCAPycler?96實時熒光定量PCR儀（瑞典羅氏公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)、細胞分組及氧葡萄糖剝奪/再灌注（OGD/R）損傷實驗

SH－SY5Y細胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞每2～3 d 換液1 次。在后續(xù)的實驗中，細胞以適當的密度接種在96孔板或6孔板上。

將細胞隨機分為6 組：正常組，模型組，尼莫地平組和CAP 低、中、高劑量組。為了模擬體外I/R 條件，除正常組仍常規(guī)培養(yǎng)外，對其余5 組SH－SY5Y細胞進行OGD/R 處理。細胞用無葡萄糖Earle 的平衡鹽溶液洗滌2 次，將培養(yǎng)基替換為EBSS，然后，將細胞移入含有5% CO2和95% N2的混合氣體的培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)4 h。經過OGD 處理后，換成正常培養(yǎng)基，放入含5% CO2的正常培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24 h。在整個OGD/R 過程中，給予尼莫地平組5 μg/mL 的尼莫地平，分別給予CAP 低、中、高劑量組1、5、25 μmol/L 的CAP。

1.3 細胞活力評估及Hoechst 33342 染色觀察凋亡細胞核的形態(tài)學變化

將MTT（5 mg/mL，20 μL/孔）添加到96 孔板（約6×103/孔）中作用4 h。然后，將生成的藍色甲酰胺還原產物（活細胞中的琥珀酸脫氫酶對染料的作用）溶解在150 μL二甲基亞砜中，使用酶標儀在490 nm處讀取其吸光度。

細胞接種于6 孔板，分組處理后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入4%多聚甲醛0.5 mL，4 ℃固定30 min。吸去固定液，加入PBS 洗滌2 遍，每次3 min，然后把液體吸凈。每孔加入Hoechst 33342染色液0.5 mL，避光染色10 min，中間手動晃動數次。之后再用PBS 洗滌2 遍，每次3 min。熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.4 LDH漏出檢測

當細胞受到OGD/R 損傷時，細胞內的LDH 會迅速釋放到培養(yǎng)上清液中。細胞損傷情況用LDH檢測試劑盒測定。采集培養(yǎng)的SH－SY5Y 細胞的上清液，3 000 ×g離心10 min，按說明書要求進行處理。在450 nm處檢測吸光度。

1.5 Caspase－3、Caspase－9活性檢測

使用Caspase－3、Caspase－9 活性檢測試劑盒進行檢測，嚴格按說明書要求操作。胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養(yǎng)液中。4 ℃，600 ×g離心5 min，收集細胞，小心吸除上清液，PBS 洗滌1 次。每200 萬細胞加入100 μL 裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。4 ℃，16 000 ×g離心10 min。把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。立即測定Caspase－3、Caspase－9的酶活性或－70 ℃保存樣品待測。

1.6 實時熒光定量檢測Bcl－2、Bax mRNA的表達

使用Trizol 法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定A260 和A280，計算RNA 濃度。逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA。使用熒光定量TB Green?Premix Ex Taq ?Ⅱ試劑盒進行實時熒光定量PCR 反應。 引物序列為：Bax 上游為5′ －AGCGACTGATGCAGCCTGCAGT－3′，下游為5′ －CCAGAGCCCACAGTCAGTTCCAG－3′；Bcl－2 上游為5′－ATGTGTGTGGAGAGCGCAGAA －3′，下游為5′－ACAGTCAPCACAAAGGCACAPC－3′；β－actin 上游為5′－AGCGAGCACAGCCCCAAAGTT－3′，下游為5′－GGGCACGAAGGCCAGACAGATT－3′。反應條件如下：先95 ℃30 s預變性，隨后95 ℃5 s，60 ℃20 s，共循環(huán)40次。按照2－△△Ct法計算各基因的相對表達量。

1.7 基于網絡藥理學探討CAP 治療缺血性卒中的潛在分子作用機制

1.7.1 CAP 潛在作用靶點及缺血性卒中相關靶點的篩選

分別采用TCMSP、drug bank、DGldb、CTD 和Swiss target prediction 數據庫檢索及預測CAP 的靶點。將靶點合并，用Uniprot 數據庫將蛋白質名稱轉變?yōu)榛蛎Q，去除重復的靶點。

以cerebral ischemic stroke 和cerebral infarction 作為關鍵詞搜索drug bank、OMIM、GENE CARD、Disgenet和TTD 數據庫獲得缺血性卒中相關靶點，選擇人源靶點，將所有靶點合并，去除重復靶點。

1.7.2 CAP 抗缺血性卒中作用靶點的獲得及功能富集分析

將缺血性卒中疾病相關靶點和CAP 潛在靶點取交集，得出藥物和疾病間的共同靶點，即CAP 抗缺血性卒中作用靶點。

功能富集分析包括基因本位（GO）生物過程富集分析和KEGG 通路的富集分析。GO［包括生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）］和KEGG 途徑富集分析是描述候選靶點特征的常用方法。在本研究中，采用DAVID（https：//david.nicifcrf.gov/）數據庫（高通量功能注釋生物信息學的在線平臺）對CAP 抗缺血性卒中作用靶點進行GO和KEGG通路分析。

1.7.3 實驗驗證

1.7.3 .1 CAP介導的神經保護機制

為了確定PI3K是否參與了CAP的神經保護作用，在96 孔板（每孔6 × 103個細胞）中加入CAP 前1 h，向細胞中添加抑制劑（LY294002，10 μmol/L）。然后用MTT法測定其存活率。

1.7.3 .2 實時熒光定量檢測PI3K、AKT mRNA的表達

使用Trizol 法提取細胞總RNA，使用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA。使用熒光定量TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒進行實時熒光定量PCR 反應。 引物序列為：PI3K 上游為5′ －CGAGGTTTTGCTGTTCGGTG－3′，下游為5′ －CAGGCCAAACCTCTGGCTAA－3′；Akt 上游為5′－CAGGATGTGGACCAACGTGA －3′，下游為 5′ －AAGGTGCGTTCGATGACAGT－3′；β－actin 上游為5′－AGCGAGCACAGCCCCAAAGTT－3′，下游為5′－GGGCACGAAGGCCAGACAGATT－3′。按照2－△△Ct法計算各基因的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 軟件對所得數據進行單因素方差分析（ANOVA），計量資料采用均數±標準差（±s）表示，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CAP對細胞活力的影響

與正常組相比，模型組細胞活力明顯下降（P<0.01）。而與模型組相比，CAP 中、高劑量組能顯著升高OGD/R 細胞的活力（P<0.05，P<0.01），而CAP 低劑量組的作用則不明顯。見圖1。

圖1 OGD/R干預下CAP對細胞活力的影響

2.2 CAP對SH－SY5Y細胞核形態(tài)的影響

Hoechst 33342 染色后，正常組細胞的細胞核染色較均勻，形態(tài)接近，熒光彌散。模型組出現較多凋亡細胞，凋亡細胞的細胞核由于核濃集、固縮，呈團塊狀結構，熒光染色不均勻，另有些核呈分葉、碎片狀。而與模型組相比，尼莫地平組和CAP 高劑量組凋亡細胞明顯減少，細胞形態(tài)接近正常。見圖2。

圖2 CAP對SH－SY5Y細胞核形態(tài)的影響（Hoechst 33342染色，×400）

2.3 CAP對LDH水平、Caspase－3和Caspase－9活性的影響

與正常組相比，模型組LDH 水平和Caspase－3、Caspase－9 活性均顯著升高（P <0.01）；與模型組比較，CAP 中、高劑量組LDH 水平明顯降低（P <0.05，P <0.01），Caspase－3、Caspase－9 活性也明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見表1。

表1 CAP對LDH 水平、Caspase－3、Caspase－9活性的影響（±s）

表1 CAP對LDH 水平、Caspase－3、Caspase－9活性的影響（±s）

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Caspase－9 100 212.64±29.08##149.83±16.43**193.27±18.63 168.97±23.45*134.60±15.56**組別正常組模型組尼莫地平組CAP低劑量組CAP中劑量組CAP高劑量組n3 3 3 3 3 3 LDH 100 234.57±28.83##143.34±19.87**207.32±31.56 179.84±29.54*148.85±31.42**Caspase－3 100 249.57±31.87##158.88±19.98**218.58±27.54*195.17±16.08*167.41±24.76**

2.4 CAP對Bcl－2、Bax mRNA表達的影響

與正常組相比，模型組Bax mRNA 表達顯著升高（P <0.01），Bcl－2 mRNA 表達顯著下降（P <0.01）。與模型組比較，CAP 中、高劑量組能明顯增加Bcl－2 mRNA 表達，降低Bax mRNA 表達（P <0.05，P <0.01），而CAP 低劑量組的作用則不明顯。見表2。

表2 CAP對Bcl－2、Bax mRNA表達的影響（±s）

表2 CAP對Bcl－2、Bax mRNA表達的影響（±s）

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Bax/β－actin 1 1.71±0.31##1.42±0.16**1.63±0.17 1.52±0.21*1.38±0.19**組別正常組模型組尼莫地平組CAP低劑量組CAP中劑量組CAP高劑量組n3 3 3 3 3 3 Bcl－2/β－actin 1 0.52±0.05##0.83±0.07**0.61±0.05 0.73±0.04*0.80±0.06**

2.5 基于網絡藥理學探討CAP 治療缺血性卒中的潛在作用機制

2.5.1 CAP 的潛在靶點預測及缺血性卒中疾病相關靶點篩選結果

分別采用TCMSP、drug bank、DGldb、CTD 和Swiss target prediction 數據庫檢索及預測CAP 的靶點。剔除非人源靶點，去除重復的靶點，共獲得了90 個CAP 活性成分的靶點，包括AKT1、VEGFA、BCL2、CASP3、MAPK1、FOS、PTGS2等。

通過drug bank、GENE CARD、OMIM、TTD、Disgenet數據庫檢索缺血性卒中疾病相關靶點，靶點合并，去除重復靶點，建立疾病靶點數據庫。共獲得1 552個缺血性卒中的疾病相關靶點，包括ALDH2、ABO、ZFHX3、ACTA2、PROCR、PDE3A、LOX、COL4A1等。

2.5.2 藥物疾病共同靶點及共同靶點的功能富集分析

將預測的90個CAP 活性成分的靶點和1 552個缺血性卒中的疾病相關靶點取交集，得出藥物疾病共同靶點59 個，即為CAP 抗缺血性卒中作用靶點。見圖3、圖4。

圖3 CAP預測靶點和缺血性卒中靶點交集的韋恩圖

圖4 CAP治療缺血性卒中的潛在靶點

GO 通路分析結果表明，其生物學過程（BP）主要富集于認知、學習和記憶、肽基絲氨酸磷酸化等。細胞成分（CC）主要富集于神經元細胞體、突觸前膜的組成成分、膜筏等。分子功能（MF）主要富集于血紅素結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、激活轉錄因子結合等。見圖5。

圖5 CAP抗缺血性卒中主要有效成分靶點GO通路富集

此外，筆者還進行了KEGG 途徑分析，用以探討CAP 抗缺血性卒中的生物學途徑。富集顯著的前5 個信號通路依次為PI3K/Akt 信號通路、cAMP 信號通路、神經營養(yǎng)素信號通路、HIF－α 信號通路和TNF－α 信號通路。其中PI3K/Akt 信號通路富集最顯著。見圖6。

圖6 CAP抗缺血性卒中主要有效成分靶點KEGG通路富集

2.5.3 PI3K介導的CAP神經保護機制

為了確定PI3K 是否參與保護SH－SY5Y 細胞在OGD/R 作用下的生存能力，在OGD/R 過程中用CAP 和LY294002（阻斷PI3K）處理細胞，結果表明在OGD/R期間抑制PI3K 顯著降低了CAP 的保護作用。此外，LY294002對細胞無影響。見圖7。

圖7 OGD/R干預下PI3K（B）抑制劑對CAP的細胞活性保護作用的影響

2.5.4 CAP對PI3K、Akt mRNA的表達的影響

與正常組相比，CAP 中、高劑量組可顯著增加PI3K、Akt mRNA 表達水平（P< 0.05，P< 0.01），而GAP低劑量組的作用則不明顯（P>0.05）。見圖8。

圖8 CAP對PI3K，Akt mRNA表達的影響

3 討論

作為缺血的體外模型，OGD/R 模型廣泛應用于神經生化變化以及腦缺血損傷機制的體外研究中［13］。細胞活性在評價神經保護藥物治療缺血性腦疾病的有效性中起著重要作用。本研究發(fā)現，在缺血損傷的SHSY5Y 細胞模型中，用CAP 治療可顯著增加細胞的MTT 檢測的OD 值，這一研究結果表明，CAP 對OGD/R誘導的損傷具有保護作用。LDH 是一種參與乳酸產生的糖酵解酶，存在于各種組織的細胞漿中。LDH 的釋放與細胞膜完整性的破壞有關，通常被看作細胞毒性的指標［14］。LDH 水平的升高表明細胞膜完整性降低。在本研究中，CAP 預處理可顯著降低OGD/R 損傷后的LDH 釋放率。因此，CAP 可以保護細胞膜完整性免受OGD/R誘導的損傷。

腦缺血可誘導凋亡調節(jié)基因的表達，如Bax 和Bcl－2。腦缺血損傷相關的細胞凋亡是導致腦I/R 后細胞死亡的主要機制之一［15］。Bax 是一種凋亡前蛋白，與Bcl－2具有顯著的序列同源性，激活Bax可加速細胞程序性死亡［16］。Bcl－2 是一種抗凋亡蛋白，能阻止細胞色素C 釋放到細胞質中，這是細胞凋亡過程中的重要步驟［17］。Bcl－2 和Bax 通過形成同二聚體和異二聚體來調節(jié)細胞的凋亡。Bax 的過度表達可導致同二聚體的形成，誘導凋亡。相反，過度表達Bcl－2 可導致異二聚體的形成，從而抑制Bax 異二聚體誘導的細胞凋亡［18］。因此，Bcl－2/Bax 的比值能夠調節(jié)腦缺血損傷引起的細胞凋亡。已知在Caspase家族中，特別是Caspase－3 和Caspase－9 活性，在細胞凋亡的執(zhí)行中起著中心作用［19］。在本研究中，OGD/R 模型組Caspase－3 和Caspase－9 活性增高以及Bax mRNA 的上調、Bcl－2 mRNA 的下調共同導致了凋亡事件，而CAP 治療可抑制缺血損傷后Caspase－3 和Caspase－9活性升高及Bax mRNA 的上調，Bcl－2 mRNA 表達增強。這些結果表明，CAP 對OGD/R 所誘導細胞凋亡導致的神經損傷具有保護作用。

為了進一步闡明CAP 的藥理機制，筆者采用網絡藥理學的方法，對CAP 治療缺血性腦卒中的作用機制進行研究。網絡藥理學作為一門新興學科，建立在系統(tǒng)生物學的一般概念之上［20］，常用于系統(tǒng)評價多成分藥物的藥理作用［21］。此外，最近也有研究提供了類似的方法來揭示各種復雜慢性疾病的分子機制，如神經病變和心腦血管疾病［22］。因此，基于大量現有數據庫的網絡分析可以初步了解多靶點藥物治療復雜疾病的機制。本文先使用TCMSP、drug bank、DGldb 和CTD 數據庫檢索并使用Swiss target prediction 預測了CAP 的靶點，并使用drug bank、OMIM、GENE CARD、Disgenet 和TTD 數據庫獲得缺血性卒中相關靶點，二者取交集，即CAP 抗缺血性卒中作用靶點。筆者對59 個CAP 治療缺血性卒中的靶點進行了KEGG 途徑分析，以此探討CAP 抗缺血性卒中的生物學途徑。富集顯著的前5 個信號通路依次為PI3K/Akt 信號通路、cAMP 信號通路、神經營養(yǎng)素信號通路、HIF－α 信號通路、TNF－α 信號通路。其中PI3K/Akt 信號通路富集最顯著。

研究表明，在生理和病理生理條件下，磷酸肌醇－3－激酶/Akt（PI3K/Akt）途徑在調節(jié)細胞生長、增殖和存活中起著核心作用［23］，并且PI3K/Akt 途徑在缺血誘導的凋亡中起著重要作用［24］。已有研究證實，PI3K/Akt 途徑能夠上調抗凋亡蛋白并下調凋亡前蛋白［25］。在本研究中，筆者使用PI3K 抑制劑LY294002 來確定PI3K 激活是否參與了SH－SY5Y 細胞中OGD/R 損傷下的CAP的神經保護作用。結果顯示，LY294002可以消除由CAP 誘導的神經保護作用，同時與正常組相比，CAP 中、高劑量組可顯著增加PI3K、Akt mRNA 的表達水平（P<0.05，P<0.01），這些均提示CAP 的神經保護作用是通過激活PI3K/AKT通路來實現的。

綜上，本研究證實了CAP 對OGD/R 誘導的神經元損傷的神經保護作用。CAP 能減輕OGD/R 誘導的SH－SY5Y 細胞損傷，減少細胞凋亡，這可能與激活PI3K/AKT 信號通路有關。由于腦I/R 損傷涉及多種信號通路的激活，其發(fā)生機制極其復雜，CAP是否還對別的通路如cAMP 信號通路等存在影響，仍有待進一步的研究。