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        基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術探討四君子湯治療IBS-D的分子靶點與作用機制研究

        2021-10-11 01:59:16牛媛媛汪龍德毛蘭芳胥文娟張萍符博雅
        中醫(yī)藥信息 2021年9期
        關鍵詞:數(shù)據(jù)庫

        牛媛媛,汪龍德,毛蘭芳,2,胥文娟,3,張萍,符博雅

        (1.甘肅中醫(yī)藥大學,甘肅 蘭州 730000;2.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730020;3.甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州 730050)

        腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是一種較為普遍的功能性胃腸道疾病,根據(jù)糞便的突出形式進一步分為腹瀉型、便秘型和混合型。其中患病率較高的是腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome,IBS-D),有研究表明IBS-D的進展與直腸急迫、頻率增加、壓力相關腹脹和稀水樣便有關[1]。IBS-D 的患病率約占該類疾病的1/3 以上[2],據(jù)有關數(shù)據(jù)統(tǒng)計,北美成年人IBS-D 的患病率約為10%~12%,且在50 歲以下的女性患者中較為常見[3]。我國IBS-D 患病人數(shù)占消化病科IBS 門診人數(shù)的半數(shù)以上,IBS-D 致病因素多樣且復發(fā)率高,給患者的生活帶來嚴重困擾[4]。

        中醫(yī)學中沒有腹瀉型腸易激綜合征這一現(xiàn)代醫(yī)學病名記載,根據(jù)其臨床表現(xiàn)及病理特征,多將其歸為“泄瀉”“下注”“鶩溏”等范疇。致病因素不外乎外感六淫、七情內(nèi)傷、飲食不調等方面,病機關鍵為“脾虛不運,濕困脾土”,治宜益氣健脾滲濕止瀉。益氣健脾的代表方四君子湯論治IBS-D 的理論淵源可考于《太平惠民和劑局方》卷三,書中記載:“心腹脹滿,全不思食,腸鳴泄瀉,嘔噦吐逆,大宜服之”。基于此,本研究通過網(wǎng)絡藥理學結合分子對接手段,預測四君子湯干預IBS-D 的效應機制,以期為四君子湯的臨床潛在應用價值開發(fā)及更深層次的實驗研究提供科學依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 篩選四君子湯有效成分

        設置口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18,采用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取“黨參、茯苓、甘草”三味中藥的有效成分,在中藥系統(tǒng)藥理學成分分析平臺BATMAN 數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php)中設定Score ≥20,對“炒白術”成分及相關靶點進行篩選。

        1.2 預測四君子湯的作用靶點與腹瀉型腸易激綜合征的疾病靶點

        基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫平臺和BATMAN 數(shù)據(jù)庫預測得到四君子湯的成分靶點,進一步深入探索并提取相應成分的作用靶點,選擇Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)獲取基因注釋文件。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/),以“Diarrhea predominant irritable bowel syndrome”為關鍵詞搜索,得到疾病相關的基因文件,構建藥物靶點與疾病靶點交集,獲得四君子湯與疾病IBS-D 的交集靶點文件,即四君子湯治療IBS-D的潛在作用靶點。

        1.3 構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡

        將“1.2”中相關藥物與疾病的基因交集進行數(shù)據(jù)軟件的輸入,利用Cytoscape 3.8.0軟件進行“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡可視化的構建,而后進行網(wǎng)絡圖節(jié)點的分析,常規(guī)選用CytoNCA 插件同時將type 文件進行輸出,對每個代表藥物、疾病或者有效成分、靶基因屬性的節(jié)點進行標注與說明,其中輸出的molLists文件則代表分子屬性的有效成分,即四君子湯治療IBS-D的有效成分。

        1.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建與分析

        利用TRING 11.0 軟件(http://string-db.org)將“1.3”中獲得的藥物-疾病交集靶基因文件進行數(shù)據(jù)導入,并將“homo sapiens”作為物種限定。進而將置信度高于0.95 的數(shù)據(jù)優(yōu)先選取,完整構建中藥復方制劑四君子湯的蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡,最后根據(jù)網(wǎng)絡中基因與鄰接基因的數(shù)目,確定該網(wǎng)絡中的核心基因。

        1.5 GO和KEGG富集分析

        將“1.4”研究所得PPI 網(wǎng)絡中的靶點蛋白進行匯總,GO 分析與通路KEGG 分析可選擇使用R 語言bioconductor 包(http://www.bioconductor.org/)分別進行,篩選結果生成圖表以進行可視化結果判讀分析。

        2 結果

        2.1 四君子湯活性成分的篩選

        通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和BATMAN 數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)檢索并得到四君子湯有效成分共計133個。TCMSP 數(shù)據(jù)庫中以“OB ≥30%和DL ≥0.18”為條件篩選后得到甘草92 個,茯苓15 個,黨參21 個;BATMAN 數(shù)據(jù)庫得到炒白術5個。

        2.2 四君子湯作用靶點與IBS-D疾病靶點信息

        利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫預測得到的四君子湯成分靶點經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫基因注釋后得到的Symbol 文件共290 個注釋基因;通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索后得到1 913個與IBS-D相關的基因。取四君子湯與IBS-D疾病的交集靶點,共獲得196個交集基因。見圖1。

        圖1 藥物成分與疾病的交集基因

        2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡

        利用Cytoscape 3.8.0 繪制四君子湯治療IBS-D的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖。見圖2?!盎衔铮悬c-疾病”網(wǎng)絡共含有400 個節(jié)點和1 972 條邊。通過CytoNCA 分析發(fā)現(xiàn)四君子湯中前十位的活性成分為:7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、刺果甘草查耳酮(glypallichalcone)、芒柄花黃素(formononetin)、柚皮素(naringenin)、美迪紫檀素(medicarpin)、異鼠李素(isorhamnetin)、光甘草定(glabridin)、豆甾醇(stigmasterol)。見表1。

        圖2 四君子湯“藥物-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡調控圖的構建

        表1 四君子湯治療IBS-D的關鍵化合物(前十位)

        2.4 構建PPI網(wǎng)絡

        將“2.3”中規(guī)范化后的共有靶點基因輸入STRING網(wǎng)站,基因類型選擇人類(homo sapiens)并設置最小關系值≥0.95,刪除無連接節(jié)點,生成藥物-疾病共有靶點PPI 網(wǎng)絡。見圖3。將結果導出,輸入Cytoscape 3.8.0 軟件,進行拓撲參數(shù)分析,得出PPI 網(wǎng)絡共13 個節(jié)點,53 條邊,其中度值排名前十位的靶蛋白為JUN、STAT3、MAPK3、MAPK1、FOS、RELA、MYC、IL6、TP53和IL2。

        圖3 “四君子湯-腹瀉型腸易激綜合征”共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡圖

        2.5 靶蛋白的富集分析

        2.5.1 GO富集分析

        將藥物-疾病共同靶點輸入R 語言bioconductor包中,分別進行分子功能(GO molecular functions)、生物途徑功能(GO biological processes)和細胞成分(GO cellular components)三個方面的GO 富集分析,取排名前十位的條目制作條形圖,條形越下P 越小。見圖4。GO 富集分析網(wǎng)絡涉及的分子功能(MF)主要包括類固醇激素受體活性、轉錄因子活性、泛素樣蛋白連接酶結合和信號受體激活因子的活性等方面。GO 富集分析網(wǎng)絡涉及的細胞成分(CC)主要與膜微結構域、胞外基質膠原、小凹等細胞組分有關。GO 富集分析網(wǎng)絡涉及的生物過程(BP)主要體現(xiàn)在氧化應激反應、脂多糖、類固醇激素反應、腺發(fā)育、細胞的化學應激反應等途徑。

        圖4 “四君子湯-腹瀉型腸易激綜合征”共同靶點的GO富集分析

        2.5.2 KEGG通路分析

        將藥物-疾病共同靶點輸入R 語言bioconductor包中,選取P較小、Count數(shù)較大的前30個通路,利用氣泡圖進行可視化。見圖5。X 軸是P 的大小,Y 軸是通路名稱,氣泡圖的大小代表Count 數(shù)目,顏色越深代表P 越小。由KEGG 富集分析結果可知,四君子湯治療IBS-D 的作用途徑與信號通路是復雜多樣的,最有可能與糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、前列腺癌通路、脂質與動脈粥樣硬化通路、乙肝通路、IL-17信號通路和卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等作用途徑相關。

        圖5 “四君子湯-腹瀉型腸易激綜合征”共同靶點的KEGG通路分析

        2.6 分子對接

        分子對接是目前已知并常規(guī)選擇來進行預測配體與已知三維結構蛋白結合性的技術,本研究將PPI 網(wǎng)絡中發(fā)現(xiàn)的度值排名靠前的三個靶點蛋白進行分子對接,分子模擬對接的具體結果可由AutoDock 軟件產(chǎn)生,通常意義上認為配體與分子在結合過程中能力需求越低,則二者之間對接成功率越高,易發(fā)揮生物效應,同時有助于成功結合后構象的穩(wěn)定維持,若結合能< 0 kJ/mol 則認為配體與靶蛋白可自行結合。見表2。

        表2 四君子湯度值前三位活性成分與靶點蛋白結合能

        取degree 值位列前三的蛋白質與化合物結合進行可視化處理。見圖6。結果顯示,各化合物與蛋白對接的結合能均<0 kJ/mol,說明各化合物與各蛋白均能較好結合。

        3 討論

        益氣健脾之基礎方四君子湯由人參(目前臨床治療多采用黨參替代)、茯苓、炒白術、炙甘草四味甘溫和緩之品組成,方簡力專,為治療脾胃虛弱型腸易激綜合征的常用方劑之一。本研究篩選出四君子湯有效活性成分133 個,可作用于IBS-D 的作用靶點196 個,這與中藥復方制劑多成分、多靶點干預疾病的特性相吻合。腦腸互動異常、免疫功能紊亂、內(nèi)臟高敏感性、抑郁伴焦慮、腸道菌群失調、胃腸動力異常以及腸道黏膜屏障損傷等致病因素與IBS-D 的發(fā)病具有相關性,提示調節(jié)腸道免疫系統(tǒng)功能、改變腸道通透性與微生物群可能是干預IBS-D 的重要方向之一[5]。有研究發(fā)現(xiàn),四君子湯在改善腸道運動與吸收功能、修復腸道黏膜屏障損傷、調節(jié)腸道菌群數(shù)量及豐度等方面均顯示出良好的干預作用[6-8]。由此可見,四君子湯治療IBS-D 的作用機制可能與調節(jié)腸道微生態(tài)、恢復腸道黏膜免疫功能、修復機械屏障損傷有關。

        本研究對四君子湯的有效成分進行了篩選,發(fā)現(xiàn)排名靠前的分別是7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)和刺果甘草查耳酮(glypallichalcone)4 個核心化合物,提示這可能是四君子湯干預IBS-D 的核心藥效成分。TOZLU M 等[9]研究發(fā)現(xiàn),炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)患者在臨床癥狀明顯緩解后,可出現(xiàn)IBS-D 樣癥狀,同時觀察到這部分患者血清中嗜酸性粒細胞增多,提示炎癥反應可能參與了感染后腸易激綜合征(Post-infective irritable bowel syndrome,PI-IBS)過程。山柰酚是一種廣泛存在于不同植物中的天然黃酮醇,已被證實具有強大的抗炎特性,可用于多種疾病的防治研究[10]。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物,具有抗氧化、抗癌、抗炎和神經(jīng)保護作用[11]。臨床研究亦證實,四君子湯加減論治脾虛型IBS 患者的療效優(yōu)于馬來酸曲美布汀片組,其作用機制與調節(jié)腸黏膜5-羥色胺受體的表達、抑制血清中炎癥的水平有關[12]。本研究結果與文獻報道相類似,在四君子湯干預IBS-D 的靶點蛋白互作網(wǎng)絡中發(fā)現(xiàn)炎癥細胞因子白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-2(IL-2)參與其中,KEGG 通路富集分析結果同樣也提示四君子湯治療IBS-D 的信號途徑與IL-17 信號通路有關。由此可見,四君子湯治療的IBS-D的分子靶點與作用機制可能與調控炎癥信號途徑,抑制炎癥反應激活有關。

        JUN 蛋白、信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)為四君子湯干預IBS-D 的潛在優(yōu)勢靶點蛋白。c-Jun 是二聚體轉錄因子激活因子蛋白-1(AP-1)復合物中研究最廣泛的蛋白分子,且能夠對影響組織生長發(fā)育和疾病進展的不同信號進行串擾、放大和整合,從而調控細胞的增殖、凋亡、生存以及腫瘤發(fā)生和組織形態(tài)的變化[13-15]。STAT3是一種關鍵的信號分子開關,在多種細胞因子和激酶之間的溝通中起著橋梁作用。另一方面,在腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中,STAT3又可作為調節(jié)抗腫瘤免疫反應的中心,影響癌細胞的代謝[16-18]。MAPK1 作為一種可被胞外不同信號刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶在多種癌癥相關的線粒體自噬過程中發(fā)揮重要作用[19]。此外,有研究報道超重及過度肥胖與IBS-D 發(fā)病之間的關聯(lián)性,肥胖型IBS 患者血清中低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)水平的過表達已被證實是影響該類疾病的獨立危險因素,更深層次的理論探究可解釋體重指數(shù)(BMI)與肥胖型IBS患者出現(xiàn)腹瀉癥狀之間的關系,即腸道局部炎癥反應引起脂肪吸收改變或腸道微生物組的改變,進而加重或誘發(fā)IBS-D[20-21]。有研究發(fā)現(xiàn),小檗堿治療代謝相關脂肪性肝病合并IBS-D 的療效確切,可明顯減少患者腹瀉次數(shù)、降低BMI指數(shù)及甘油三酯、膽固醇等水平[22]。上述文獻報道與GO 富集分析中的氧化應激、脂多糖及KEGG 通路富集分析中的前列腺癌通路、脂質與動脈粥樣硬化通路等研究結果相吻合,可見四君子湯治療IBS-D 的作用途徑可能與細胞的增殖與凋亡、腫瘤及糖脂代謝等相關分子蛋白及信號通路密切相關。

        綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術,預測了四君子湯干預IBS-D 的多成分-多靶點-多通路的效應機制,即四君子湯治療IBS-D 分子靶點及作用機制可能與調節(jié)腸道微生態(tài),恢復腸道黏膜免疫功能、修復機械屏障損傷、抑制炎癥反應激活、調控細胞的增殖與凋亡、腫瘤及糖脂代謝等途徑有關。這一結論可為進一步研究提供理論支撐與科學依據(jù)。

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