牛媛媛，汪龍德，毛蘭芳，2，胥文娟，3，張萍，符博雅

（1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是一種較為普遍的功能性胃腸道疾病，根據(jù)糞便的突出形式進一步分為腹瀉型、便秘型和混合型。其中患病率較高的是腹瀉型腸易激綜合征（Diarrhea－predominant irritable bowel syndrome，IBS－D），有研究表明IBS－D的進展與直腸急迫、頻率增加、壓力相關腹脹和稀水樣便有關［1］。IBS－D 的患病率約占該類疾病的1/3 以上［2］，據(jù)有關數(shù)據(jù)統(tǒng)計，北美成年人IBS－D 的患病率約為10%～12%，且在50 歲以下的女性患者中較為常見［3］。我國IBS－D 患病人數(shù)占消化病科IBS 門診人數(shù)的半數(shù)以上，IBS－D 致病因素多樣且復發(fā)率高，給患者的生活帶來嚴重困擾［4］。

中醫(yī)學中沒有腹瀉型腸易激綜合征這一現(xiàn)代醫(yī)學病名記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)及病理特征，多將其歸為“泄瀉”“下注”“鶩溏”等范疇。致病因素不外乎外感六淫、七情內(nèi)傷、飲食不調等方面，病機關鍵為“脾虛不運，濕困脾土”，治宜益氣健脾滲濕止瀉。益氣健脾的代表方四君子湯論治IBS－D 的理論淵源可考于《太平惠民和劑局方》卷三，書中記載：“心腹脹滿，全不思食，腸鳴泄瀉，嘔噦吐逆，大宜服之”。基于此，本研究通過網(wǎng)絡藥理學結合分子對接手段，預測四君子湯干預IBS－D 的效應機制，以期為四君子湯的臨床潛在應用價值開發(fā)及更深層次的實驗研究提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 篩選四君子湯有效成分

設置口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug－likeness，DL）≥0.18，采用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲取“黨參、茯苓、甘草”三味中藥的有效成分，在中藥系統(tǒng)藥理學成分分析平臺BATMAN 數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman－tcm/index.php）中設定Score ≥20，對“炒白術”成分及相關靶點進行篩選。

1.2 預測四君子湯的作用靶點與腹瀉型腸易激綜合征的疾病靶點

基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫平臺和BATMAN 數(shù)據(jù)庫預測得到四君子湯的成分靶點，進一步深入探索并提取相應成分的作用靶點，選擇Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）獲取基因注釋文件。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/），以“Diarrhea predominant irritable bowel syndrome”為關鍵詞搜索，得到疾病相關的基因文件，構建藥物靶點與疾病靶點交集，獲得四君子湯與疾病IBS－D 的交集靶點文件，即四君子湯治療IBS－D的潛在作用靶點。

1.3 構建“藥物－成分－靶點－疾病”網(wǎng)絡

將“1.2”中相關藥物與疾病的基因交集進行數(shù)據(jù)軟件的輸入，利用Cytoscape 3.8.0軟件進行“藥物－成分－靶點－疾病”網(wǎng)絡可視化的構建，而后進行網(wǎng)絡圖節(jié)點的分析，常規(guī)選用CytoNCA 插件同時將type 文件進行輸出，對每個代表藥物、疾病或者有效成分、靶基因屬性的節(jié)點進行標注與說明，其中輸出的molLists文件則代表分子屬性的有效成分，即四君子湯治療IBS－D的有效成分。

1.4 蛋白－蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建與分析

利用TRING 11.0 軟件（http：//string－db.org）將“1.3”中獲得的藥物－疾病交集靶基因文件進行數(shù)據(jù)導入，并將“homo sapiens”作為物種限定。進而將置信度高于0.95 的數(shù)據(jù)優(yōu)先選取，完整構建中藥復方制劑四君子湯的蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡，最后根據(jù)網(wǎng)絡中基因與鄰接基因的數(shù)目，確定該網(wǎng)絡中的核心基因。

1.5 GO和KEGG富集分析

將“1.4”研究所得PPI 網(wǎng)絡中的靶點蛋白進行匯總，GO 分析與通路KEGG 分析可選擇使用R 語言bioconductor 包（http：//www.bioconductor.org/）分別進行，篩選結果生成圖表以進行可視化結果判讀分析。

2 結果

2.1 四君子湯活性成分的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和BATMAN 數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)檢索并得到四君子湯有效成分共計133個。TCMSP 數(shù)據(jù)庫中以“OB ≥30%和DL ≥0.18”為條件篩選后得到甘草92 個，茯苓15 個，黨參21 個；BATMAN 數(shù)據(jù)庫得到炒白術5個。

2.2 四君子湯作用靶點與IBS－D疾病靶點信息

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫預測得到的四君子湯成分靶點經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫基因注釋后得到的Symbol 文件共290 個注釋基因；通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索后得到1 913個與IBS－D相關的基因。取四君子湯與IBS－D疾病的交集靶點，共獲得196個交集基因。見圖1。

圖1 藥物成分與疾病的交集基因

2.3 “藥物－成分－靶點－疾病”網(wǎng)絡

利用Cytoscape 3.8.0 繪制四君子湯治療IBS－D的“藥物－成分－靶點－疾病”網(wǎng)絡圖。見圖2?！盎衔铮悬c－疾病”網(wǎng)絡共含有400 個節(jié)點和1 972 條邊。通過CytoNCA 分析發(fā)現(xiàn)四君子湯中前十位的活性成分為：7－甲氧基－2－甲基異黃酮（7－Methoxy－2－methyl isoflavone）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、刺果甘草查耳酮（glypallichalcone）、芒柄花黃素（formononetin）、柚皮素（naringenin）、美迪紫檀素（medicarpin）、異鼠李素（isorhamnetin）、光甘草定（glabridin）、豆甾醇（stigmasterol）。見表1。

圖2 四君子湯“藥物－化合物－靶點－疾病”網(wǎng)絡調控圖的構建

表1 四君子湯治療IBS－D的關鍵化合物（前十位）

2.4 構建PPI網(wǎng)絡

將“2.3”中規(guī)范化后的共有靶點基因輸入STRING網(wǎng)站，基因類型選擇人類（homo sapiens）并設置最小關系值≥0.95，刪除無連接節(jié)點，生成藥物－疾病共有靶點PPI 網(wǎng)絡。見圖3。將結果導出，輸入Cytoscape 3.8.0 軟件，進行拓撲參數(shù)分析，得出PPI 網(wǎng)絡共13 個節(jié)點，53 條邊，其中度值排名前十位的靶蛋白為JUN、STAT3、MAPK3、MAPK1、FOS、RELA、MYC、IL6、TP53和IL2。

圖3 “四君子湯－腹瀉型腸易激綜合征”共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡圖

2.5 靶蛋白的富集分析

2.5.1 GO富集分析

將藥物－疾病共同靶點輸入R 語言bioconductor包中，分別進行分子功能（GO molecular functions）、生物途徑功能（GO biological processes）和細胞成分（GO cellular components）三個方面的GO 富集分析，取排名前十位的條目制作條形圖，條形越下P 越小。見圖4。GO 富集分析網(wǎng)絡涉及的分子功能（MF）主要包括類固醇激素受體活性、轉錄因子活性、泛素樣蛋白連接酶結合和信號受體激活因子的活性等方面。GO 富集分析網(wǎng)絡涉及的細胞成分（CC）主要與膜微結構域、胞外基質膠原、小凹等細胞組分有關。GO 富集分析網(wǎng)絡涉及的生物過程（BP）主要體現(xiàn)在氧化應激反應、脂多糖、類固醇激素反應、腺發(fā)育、細胞的化學應激反應等途徑。

圖4 “四君子湯－腹瀉型腸易激綜合征”共同靶點的GO富集分析

2.5.2 KEGG通路分析

將藥物－疾病共同靶點輸入R 語言bioconductor包中，選取P較小、Count數(shù)較大的前30個通路，利用氣泡圖進行可視化。見圖5。X 軸是P 的大小，Y 軸是通路名稱，氣泡圖的大小代表Count 數(shù)目，顏色越深代表P 越小。由KEGG 富集分析結果可知，四君子湯治療IBS－D 的作用途徑與信號通路是復雜多樣的，最有可能與糖尿病并發(fā)癥中的AGE－RAGE信號通路、前列腺癌通路、脂質與動脈粥樣硬化通路、乙肝通路、IL－17信號通路和卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等作用途徑相關。

圖5 “四君子湯－腹瀉型腸易激綜合征”共同靶點的KEGG通路分析

2.6 分子對接

分子對接是目前已知并常規(guī)選擇來進行預測配體與已知三維結構蛋白結合性的技術，本研究將PPI 網(wǎng)絡中發(fā)現(xiàn)的度值排名靠前的三個靶點蛋白進行分子對接，分子模擬對接的具體結果可由AutoDock 軟件產(chǎn)生，通常意義上認為配體與分子在結合過程中能力需求越低，則二者之間對接成功率越高，易發(fā)揮生物效應，同時有助于成功結合后構象的穩(wěn)定維持，若結合能< 0 kJ/mol 則認為配體與靶蛋白可自行結合。見表2。

表2 四君子湯度值前三位活性成分與靶點蛋白結合能

取degree 值位列前三的蛋白質與化合物結合進行可視化處理。見圖6。結果顯示，各化合物與蛋白對接的結合能均<0 kJ/mol，說明各化合物與各蛋白均能較好結合。

3 討論

益氣健脾之基礎方四君子湯由人參（目前臨床治療多采用黨參替代）、茯苓、炒白術、炙甘草四味甘溫和緩之品組成，方簡力專，為治療脾胃虛弱型腸易激綜合征的常用方劑之一。本研究篩選出四君子湯有效活性成分133 個，可作用于IBS－D 的作用靶點196 個，這與中藥復方制劑多成分、多靶點干預疾病的特性相吻合。腦腸互動異常、免疫功能紊亂、內(nèi)臟高敏感性、抑郁伴焦慮、腸道菌群失調、胃腸動力異常以及腸道黏膜屏障損傷等致病因素與IBS－D 的發(fā)病具有相關性，提示調節(jié)腸道免疫系統(tǒng)功能、改變腸道通透性與微生物群可能是干預IBS－D 的重要方向之一［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯在改善腸道運動與吸收功能、修復腸道黏膜屏障損傷、調節(jié)腸道菌群數(shù)量及豐度等方面均顯示出良好的干預作用［6－8］。由此可見，四君子湯治療IBS－D 的作用機制可能與調節(jié)腸道微生態(tài)、恢復腸道黏膜免疫功能、修復機械屏障損傷有關。

本研究對四君子湯的有效成分進行了篩選，發(fā)現(xiàn)排名靠前的分別是7－甲氧基－2－甲基異黃酮（7－Methoxy－2－methyl isoflavone）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）和刺果甘草查耳酮（glypallichalcone）4 個核心化合物，提示這可能是四君子湯干預IBS－D 的核心藥效成分。TOZLU M 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）患者在臨床癥狀明顯緩解后，可出現(xiàn)IBS－D 樣癥狀，同時觀察到這部分患者血清中嗜酸性粒細胞增多，提示炎癥反應可能參與了感染后腸易激綜合征（Post－infective irritable bowel syndrome，PI－IBS）過程。山柰酚是一種廣泛存在于不同植物中的天然黃酮醇，已被證實具有強大的抗炎特性，可用于多種疾病的防治研究［10］。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗癌、抗炎和神經(jīng)保護作用［11］。臨床研究亦證實，四君子湯加減論治脾虛型IBS 患者的療效優(yōu)于馬來酸曲美布汀片組，其作用機制與調節(jié)腸黏膜5－羥色胺受體的表達、抑制血清中炎癥的水平有關［12］。本研究結果與文獻報道相類似，在四君子湯干預IBS－D 的靶點蛋白互作網(wǎng)絡中發(fā)現(xiàn)炎癥細胞因子白細胞介素－6（IL－6）、白細胞介素－2（IL－2）參與其中，KEGG 通路富集分析結果同樣也提示四君子湯治療IBS－D 的信號途徑與IL－17 信號通路有關。由此可見，四君子湯治療的IBS－D的分子靶點與作用機制可能與調控炎癥信號途徑，抑制炎癥反應激活有關。

JUN 蛋白、信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）為四君子湯干預IBS－D 的潛在優(yōu)勢靶點蛋白。c－Jun 是二聚體轉錄因子激活因子蛋白－1（AP－1）復合物中研究最廣泛的蛋白分子，且能夠對影響組織生長發(fā)育和疾病進展的不同信號進行串擾、放大和整合，從而調控細胞的增殖、凋亡、生存以及腫瘤發(fā)生和組織形態(tài)的變化［13－15］。STAT3是一種關鍵的信號分子開關，在多種細胞因子和激酶之間的溝通中起著橋梁作用。另一方面，在腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中，STAT3又可作為調節(jié)抗腫瘤免疫反應的中心，影響癌細胞的代謝［16－18］。MAPK1 作為一種可被胞外不同信號刺激激活的絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶在多種癌癥相關的線粒體自噬過程中發(fā)揮重要作用［19］。此外，有研究報道超重及過度肥胖與IBS－D 發(fā)病之間的關聯(lián)性，肥胖型IBS 患者血清中低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）水平的過表達已被證實是影響該類疾病的獨立危險因素，更深層次的理論探究可解釋體重指數(shù)（BMI）與肥胖型IBS患者出現(xiàn)腹瀉癥狀之間的關系，即腸道局部炎癥反應引起脂肪吸收改變或腸道微生物組的改變，進而加重或誘發(fā)IBS－D［20－21］。有研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿治療代謝相關脂肪性肝病合并IBS－D 的療效確切，可明顯減少患者腹瀉次數(shù)、降低BMI指數(shù)及甘油三酯、膽固醇等水平［22］。上述文獻報道與GO 富集分析中的氧化應激、脂多糖及KEGG 通路富集分析中的前列腺癌通路、脂質與動脈粥樣硬化通路等研究結果相吻合，可見四君子湯治療IBS－D 的作用途徑可能與細胞的增殖與凋亡、腫瘤及糖脂代謝等相關分子蛋白及信號通路密切相關。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術，預測了四君子湯干預IBS－D 的多成分－多靶點－多通路的效應機制，即四君子湯治療IBS－D 分子靶點及作用機制可能與調節(jié)腸道微生態(tài)，恢復腸道黏膜免疫功能、修復機械屏障損傷、抑制炎癥反應激活、調控細胞的增殖與凋亡、腫瘤及糖脂代謝等途徑有關。這一結論可為進一步研究提供理論支撐與科學依據(jù)。