趙一琳，許曄瓊，陳潔，俞建峰，宛傳丹

(常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇常熟 215500)

以發(fā)熱、咳嗽、呼吸急促等呼吸系統(tǒng)癥狀為主要臨床特征的急性呼吸道感染(acute respiratory infection, ARI)，一直威脅著人類健康。新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情發(fā)生之初，我國(guó)即采取強(qiáng)有力的封閉隔離措施，通過(guò)強(qiáng)化個(gè)人防護(hù)、加強(qiáng)人口流動(dòng)管理、大力提升核酸檢測(cè)能力等一系列策略，及時(shí)切斷病毒傳播途徑[1]。目前，因新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)變異，境外部分地區(qū)COVID-19疫情嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)采取嚴(yán)格的“內(nèi)防反彈，外防輸入”的策略，雖存在較少散發(fā)病例，但不會(huì)形成大規(guī)模流行感染之勢(shì)。各級(jí)醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)重點(diǎn)管控好發(fā)熱門診就診患者，及時(shí)發(fā)現(xiàn)散發(fā)病例有利于從源頭控制住病毒傳播。本研究針對(duì)疫情常態(tài)化防控背景下冬季發(fā)熱門診疑似COVID-19患者咽拭子中可能存在的13種常見(jiàn)呼吸道病原體進(jìn)行核酸檢測(cè)分析，以研究COVID-19疫情防控形勢(shì)下其他常見(jiàn)病原體的存在與分布特征。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集2020年12月至2021年3月根據(jù)疫情防控要求，因發(fā)熱癥狀而分診至常熟市第一人民醫(yī)院、常熟市第二人民醫(yī)院與常熟市中醫(yī)院發(fā)熱門診的患者368例，其中成年組(≥18歲)291例，年齡(37.8±5.9)歲；未成年組(<18歲)77例，年齡(12.3±3.5)歲。按照SARS-CoV-2采集要求進(jìn)行咽拭子的采集、保存與送檢。所有標(biāo)本先經(jīng)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)(RT-PCR法)。呼吸道感染疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《內(nèi)科學(xué)》第3版相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.2儀器與試劑 SARS-CoV-2核酸快速提取試劑盒(磁珠法)(批號(hào)：20201121)、新型冠狀病毒核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：JC102233-1N)、SAW-96全自動(dòng)核酸提取儀(江蘇碩世公司)。13種呼吸道病原體多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒(寧波海爾施公司)，微量分光度計(jì)Onedrop(美國(guó)熱電公司)，普通PCR儀(13項(xiàng)病原體多重RT-PCR用)、QuantStudio5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(SARS-CoV-2核酸檢測(cè)用)、3500 Dx基因測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3多重RT-PCR毛細(xì)管電泳法 用13種呼吸道病原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)甲型流感病毒(influenza A virus, InfA)、腺病毒(human adenovirus,HADV)、博卡病毒(bocavirus,Boca)、鼻病毒(human rhinovirus,HRV)、甲型H1N1流感病毒、副流感病毒(human parainfluenza virus, HPIV)、衣原體(chlamydia, Ch)、偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)、乙型流感病毒(influenza B virus, InfB)、肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae, Mp)、甲型H3N2流感病毒(influenza A virus H3N2)、冠狀病毒(human coronavirus, HCoV)、呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, HRSV)。將臨床咽拭子標(biāo)本、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照(廠家試劑盒中提供)充分混勻，各吸取200 μL，加入核酸快提深孔板(預(yù)分裝試劑)，上全自動(dòng)核酸提取儀按標(biāo)準(zhǔn)提取方案進(jìn)行核酸萃取。用微量分光光度計(jì)進(jìn)行核酸純度驗(yàn)證。取5 μL核酸提取物作為擴(kuò)增模板，加入預(yù)配的15 μL混合反應(yīng)體系中。多重RT-PCR反應(yīng)參數(shù)為：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，95 ℃ 2 min。第一次循環(huán)：94 ℃ 30 s，65～60 ℃ 30 s(每次循環(huán)遞減1 ℃)，72 ℃ 60 s，共6個(gè)循環(huán)。第二次循環(huán)：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共29個(gè)循環(huán)。最后72 ℃ 10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。吸? μL產(chǎn)物加至電泳上樣液，與標(biāo)準(zhǔn)品(熒光標(biāo)記DNA片段，廠家試劑盒提供)配成混合液9 μL，在ABI 3500 Dx上導(dǎo)入設(shè)置好的參數(shù)文件，毛細(xì)管電泳55 min檢測(cè)分析。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)[3]：擴(kuò)增產(chǎn)物中目的位點(diǎn)峰高度低于該道毛細(xì)管標(biāo)準(zhǔn)品低峰(NegS)的，判該位點(diǎn)陰性；擴(kuò)增產(chǎn)物中目的位點(diǎn)峰高度高于該道毛細(xì)管標(biāo)準(zhǔn)品高峰(PosS)的，判該位點(diǎn)陽(yáng)性；擴(kuò)增產(chǎn)物中目的位點(diǎn)峰高度高于該道毛細(xì)管標(biāo)準(zhǔn)品低峰但低于標(biāo)準(zhǔn)品高峰的，判該位點(diǎn)灰區(qū)，重新進(jìn)行核酸提取、擴(kuò)增并電泳分析。若該位點(diǎn)若仍落在灰區(qū)的，判陽(yáng)性；若落在陽(yáng)性區(qū)域的，判陽(yáng)性；若落在陰性區(qū)域的，判陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad 8.0作圖，SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。率的比較用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SARS-CoV-2核酸檢測(cè) 經(jīng)雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)，所有標(biāo)本均未檢出SARS-CoV-2病毒ORF1ab/N靶基因(檢出限350 copies/mL)。

2.213種呼吸道病原檢出率 未成年組77例中，檢出陽(yáng)性67例，檢出率為87.0%，其中檢出率排前五位為InfB、HRV、InfA、HRSV與Mp，HCoV與Ch未檢出。成年組291例中，檢出陽(yáng)性116例，檢出率為39.8%，其中檢出率前五位為InfA、HRV、H3N2、InfB與HMPV；未發(fā)現(xiàn)HCoV、Boca和甲型H1N1流感病毒。未成年組檢出率高于成年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=108.366，P=0.000)。見(jiàn)表1。

表1 2020—2021年冬季發(fā)熱門診13種呼吸道病原體檢出情況[n(%)]

2.3混合感染情況 183例陽(yáng)性病例中，有34例混合感染(檢出2種及以上病原體)，陽(yáng)性病例中混合感染率占18.6%。其中，2種病原體混合感染28例，3種病原體感染3例，4種病原體感染3例。見(jiàn)圖1。

注：InfA，甲型流感病毒；HADV，腺病毒；Boca，博卡病毒；HRV，鼻病毒；HPIV，副流感病毒；HMPV，偏肺病毒；InfB，乙型流感病毒；Mp，肺炎支原體；H3N2，甲型H3N2流感病毒；HRSV，呼吸道合胞病毒。

3 討論

本文針對(duì)COVID-19疫情防控常態(tài)化背景下病毒感染流行季節(jié)中發(fā)熱門診其他常見(jiàn)13種呼吸道病原體的感染流行分布情況進(jìn)行調(diào)查研究。結(jié)果顯示，未檢出SARS-CoV-2患者仍存在其他病原體感染。13種呼吸道病原體在未成年人組檢出率87.0%，成年人組中為39.8%。從類型分析，冬季呼吸道感染流行主要的病原體為流感病毒。各年齡群中InfA、InfB檢出率均居前位，與報(bào)道基本相一致[4-5]。未成年組中，HRV、RSV、Mp檢出率較高，成年組中H3N2與HMPV檢出較高。不同人群機(jī)體免疫力不同，生活環(huán)境與方式存在差異，即使在同一地區(qū)其感染的病原體也存在差異。根本原因在于冬季區(qū)域環(huán)境中流行的病原體存在方式不同，各研究報(bào)道的呼吸道病毒檢出率均存在顯著差異[6-7]。2020—2021年COVID-19疫情常態(tài)化防控背景下，對(duì)病毒感染流行有較大程度的影響。隔離阻斷、改變社交方式等預(yù)防措施能有效降低呼吸道感染病原體的傳播。未成年組檢出率仍較高，可能是由于未成年人機(jī)體免疫尚在建立，學(xué)習(xí)活動(dòng)聚集性高，預(yù)防意識(shí)較差等因素造成。因此，未成年人群仍將是冬季流感病毒主要受眾人群。

混合感染現(xiàn)象較為普遍，檢出率在18.6%，與上海、連云港近年檢出的混合感染率基本一致[4-5]?；旌细腥径酁?種病原體感染，其中InfA/InfB混合感染現(xiàn)象最為嚴(yán)重?；旌细腥径喟l(fā)生在未成年組中，與聚集性學(xué)習(xí)生活方式可能相關(guān)。臨床要注意區(qū)分病原體種類，對(duì)其造成的感染疾病采取相應(yīng)的治療方案。3種以上病原體混合感染較少，混合感染的機(jī)制與臨床意義有待探討。

COVID-19疫情的發(fā)生大大推動(dòng)了核酸檢測(cè)在病原學(xué)診斷中的普及，而技術(shù)的自動(dòng)化發(fā)展更促進(jìn)了核酸檢驗(yàn)高效、快捷、低廉的市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)。病原學(xué)核酸檢測(cè)將成為病原學(xué)診斷重要的直接證據(jù)。