戴錦程，張宇航，曹彤，張峰，高嶺

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科，南京 210008；2.皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，安徽蕪湖 241002)

抗中性粒細胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)是一種以中性粒細胞和單核細胞胞漿成分為靶抗原的自身抗體。ANCA是血管炎診斷的重要血清學(xué)標志物，主要存在于ANCA相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)患者中。兒童AAV罕見，主要以顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis，MPA)以及肉芽腫型多血管炎(granulomatosis with polyangiitis，GPA)亞型為主，腎臟受累較成人更嚴重[1]。準確的ANCA檢測對AAV診斷、治療和預(yù)后判斷具有重要意義[2]。通過間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)檢測可以將ANCA分為核周型抗中性粒細胞胞漿抗體(perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibody，pANCA)、胞質(zhì)型抗中性粒細胞胞漿抗體(cytoplasmic antineutrophil cytoplasmic antibody，cANCA)和不典型抗中性粒細胞胞漿抗體(atypical antineutrophil cytoplasmic antibody，aANCA)3種類型。據(jù)報道，aANCA還出現(xiàn)在炎性腸病[3]、其他自身免疫病(autoimmune disease, AID)及感染的患者中。但目前國內(nèi)外缺少兒童aANCA陽性病例的報道。本研究就aANCA在兒科疾病中的陽性率及其在兒童AID中的相關(guān)臨床意義進行回顧性分析。

1 材料與方法

1.1研究對象 回顧性統(tǒng)計分析南京兒童醫(yī)院2019年1月—2020年12月住院和門診共10 638例患者的ANCA檢測結(jié)果和臨床資料。各種疾病均有明確臨床診斷，其中血管炎診斷符合Chapel Hill會議對于血管炎的分類標準[4]；過敏性紫癜診斷符合《諸福棠實用兒科學(xué)》診斷標準；混合結(jié)締組織病、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、SLE的診斷符合美國風(fēng)濕病協(xié)會診斷標準。

1.2儀器與試劑 EUPOStarⅢPlus熒光顯微鏡、Sprinter XL全自動間接免疫熒光操作/酶聯(lián)免疫一體機(德國歐蒙公司)，STAR酶免分析系統(tǒng)及FAME全自動酶免分析儀(瑞士澳斯邦公司)；ANCA IIF法檢測試劑(德國歐蒙公司)，髓過氧化物酶(myelope roxidase, MPO)和蛋白水解酶3(proteaseproteinase3, PR3)ELISA檢測試劑(德國AESKU公司)。

1.3方法

1.3.1ANCA檢測 用IIF法檢測ANCA，以HEp-2細胞、乙醇固定的中性粒細胞和甲醛固定的中性粒細胞為抗原基質(zhì)，對血清樣本進行1∶10稀釋，按試劑說明書進行操作。同時分別設(shè)置陰、陽性對照用于判斷實驗的有效性，并進行cANCA、pANCA的陽性、弱陽性、陰性質(zhì)控。ANCA的判讀標準根據(jù)中國醫(yī)師協(xié)會風(fēng)濕免疫科醫(yī)師分會自身抗體檢測專業(yè)委員會的《抗中性粒細胞胞漿抗體檢測的臨床應(yīng)用專家共識》[5]推薦，必報熒光模型：cANCA、pANCA，選報熒光模式：aANCA。不典型cANCA鑒別要點:在乙醇固定的中性粒細胞上呈現(xiàn)胞漿中均勻彌散分布的細顆粒狀熒光，在核葉間無增強的熒光染色;甲醛固定的中性粒細胞呈現(xiàn)上述一致的熒光染色或陰性。不典型pANCA鑒別要點：乙醇固定的中性粒細胞呈現(xiàn)核周胞漿的平滑絲帶狀熒光，無帶狀熒光向細胞核內(nèi)浸潤，熒光陽性均勻分布于核周，無不規(guī)則的塊狀(需排除ANA核膜型干擾)；甲醛固定中性粒細胞呈陰性，或者在甲醛固定的中性粒細胞上呈現(xiàn)胞漿中淡染、均勻彌散分布的細顆粒狀熒光，在核葉間無增強的熒光染色。

1.3.2ANCA靶抗原檢測 采用ELISA法檢測MPO和PR3，按試劑說明書進行操作，結(jié)果大于18 U/mL為陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 24.0和EXCLE軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料分析采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兒童aANCA檢出情況 在10 638例患兒中，ANCA陽性率為4.20%(447/10 638)，其中aANCA陽性率2.86%(304/10 638)，pANCA陽性患兒0.96%(102/10 638)，cANCA陽性患兒0.38%(41/10 638)。在304例aANCA患兒中，包括男性89例，女性215例。

2.2aANCA的靶抗原分布 304例aANCA陽性患兒靶抗原主要以非MPO/PR3為主[占97.04%(295/304)]，MPO陽性6例(占1.97%)，PR3陽性3例(占0.99%)。

2.3ANCA陽性患兒的疾病分布 447例ANCA陽性患兒中，AID患兒121例，aANCA陽性率為73.55%；非AID患兒326例，aANCA陽性最高為65.95%；確診為AAV有14例，其中pANCA 7例，cANCA 2例，aANCA 5例，4例在pANCA治療過程或后續(xù)隨訪中轉(zhuǎn)變?yōu)閍ANCA，此時MPO由陽性轉(zhuǎn)為陰性。見表1。

表1 447例ANCA陽性患者疾病分布[n(%)]

2.4aANCA陽性患兒在不同疾病中的分布 在304例aANCA抗體陽性患兒中，其中AID患兒為89例(29.28%)，以SLE(38例)、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(19例)、IgA腎炎(6例)為主；非AID患兒為215例(70.72%)，以過敏性紫癜患兒(119例)aANCA陽性率最高，為39.14%；其次為肺炎、支氣管炎18例，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病12例，腎炎、腎病綜合征10例。見表2。

表2 aANCA陽性患兒在不同疾病中的分布

3 討論

本研究回顧性分析了10 638例ANCA常規(guī)檢測患兒，ANCA陽性447例，占4.20%，與國內(nèi)相關(guān)報道結(jié)果一致[6]。aANCA陽性率2.86%高于pANCA、cANCA，這與兒童AAV罕見以及ANCA同時存在于其他疾病中有關(guān)。

本研究中AAV有14例，其中pANCA 7例，cANCA 2例， aANCA 5例，4例在pANCA治療過程或后續(xù)隨訪中轉(zhuǎn)變?yōu)閍ANCA，此時MPO由陽性轉(zhuǎn)為陰性。這一研究提示在臨床檢驗工作中既要規(guī)范合理應(yīng)用ANCA檢測，同時也要注重結(jié)合臨床癥狀、病情活動以及治療效果治療。

304例aANCA陽性患兒靶抗原以非MPO/PR3為主，占97.04%。用IIF法測得ANCA陽性時，cANCA或pANCA所對應(yīng)的靶抗原可能不止一種，比如cANCA對應(yīng)的靶抗原可能是PR3或者通透性增強蛋白；pANCA對應(yīng)的靶抗原可能是MPO、乳鐵蛋白、彈性蛋白酶或組織蛋白酶等，而在一些非血管炎的疾病中尚可發(fā)現(xiàn)一些非MPO/PR3靶抗原的aANCA。另一方面，ANCA陰性也不能排除小血管炎，要考慮到檢測方法的敏感性、疾病活動性、治療以及病因等因素[7]。

aANCA抗體陽性患兒中，89例AID患兒中含SLE 38例、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎19例、IgA腎炎6例，多為ANCA繼發(fā)血管炎。有研究表明，ANCA陽性與腎病有一定的關(guān)系[6]。腎臟是原發(fā)性小血管炎受累的主要部位，其主要表現(xiàn)為狼瘡腎炎、慢性腎炎、慢性腎功能不全及急性腎小球腎炎等疾病。在215例非AID患兒中，過敏性紫癜患兒119例，aANCA陽性率最高。過敏性紫癜是一種兒童常見的血管炎性疾病,以皮膚對稱性可觸性紫癜為主要表現(xiàn)，腎損害是較為嚴重的并發(fā)癥，aANCA陽性對并發(fā)癥有提示作用。在呼吸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、心臟、肝臟、皮膚等各系統(tǒng)疾病均有aANCA檢出，這與ANCA主要累及小血管，可累及全身多個器官系統(tǒng)有關(guān)，其中腎臟和肺最易受累[8]。

隨著ANCA檢測技術(shù)的發(fā)展、熒光模型判斷的規(guī)范、報告結(jié)果的應(yīng)用，越來越多的靶抗原被發(fā)現(xiàn)，ANCA以及aANCA與臨床相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后的關(guān)系被不斷研究。在兒童ANCA檢測中，應(yīng)重視aANCA的規(guī)范化檢測、靶抗原確認以及臨床合理應(yīng)用，為兒童AID的診斷、治療以及預(yù)后判斷提供更好的服務(wù)。