楊陽，張靜，吳秋月，王長軍，賈雷立，夏欣一，4，王文兵

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212000；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍檢驗醫(yī)學(xué)研究所，南京210000；3.解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京100071；4.火神山醫(yī)院檢驗科，武漢430000)

新型冠狀病毒感染后繼發(fā)細(xì)菌感染是一個重要的死亡危險因素。據(jù)統(tǒng)計國內(nèi)外多家醫(yī)院的合并感染情況的綜述報道，62/806(8%)新型冠狀病毒肺炎患者在住院期間發(fā)生細(xì)菌/真菌共感染[1]。同時有研究報道，136例新型冠狀病毒肺炎患者中有44例患者(32.4%)診斷為繼發(fā)細(xì)菌性肺炎[2]。本研究旨在比較細(xì)菌檢出陽性組和陰性組的臨床特征差異，統(tǒng)計新型冠狀病毒肺炎患者中疑似細(xì)菌感染者的菌群組成情況，為臨床抗菌藥物的使用包括經(jīng)驗性治療提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年2月11日至2020年4月9日入住武漢火神山醫(yī)院134例新型冠狀病毒肺炎患者，所有患者均按照國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的新型冠狀病毒肺炎診斷和治療指南(第3版—第7版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)收治，并經(jīng)實時熒光定量PCR檢測病毒核酸確認(rèn)。其中，包括51例普通型患者，65例重型患者，18例危重型患者。

1.2主要試劑與儀器 3D全自動血培養(yǎng)儀、Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)和配套試劑(生物梅里埃公司)，呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒(批號20180901)、Rtisochip-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀(博奧晶典公司)。

1.3標(biāo)本采集 在抗菌藥物使用前或停藥1周后進行標(biāo)本采集。(1)痰液標(biāo)本：經(jīng)清水漱口后自呼吸道深部用力咳出的第一口痰，對于無法自行咳痰的患者可采用誘導(dǎo)法或吸出法，留取量要求大于1 mL，置于帶蓋的無菌容器中2 h內(nèi)送檢，不能及時送檢的標(biāo)本置2～8 ℃保存不超過72 h。涂片鏡檢觀察痰液標(biāo)本質(zhì)量，痰標(biāo)本中鱗狀上皮細(xì)胞<10個/低倍視野、白細(xì)胞>25個/低倍視野為合格標(biāo)本。(2)全血標(biāo)本：采集后注入?yún)捬?需氧血培養(yǎng)瓶內(nèi)，立即送檢。(3)咽拭子：用無菌棉拭子越過舌根擦拭咽后壁或腭弓兩側(cè)，取出后插入無菌試管，2 h內(nèi)送檢。(4)肺泡灌洗液：通過纖維支氣管鏡采集，留取3 mL以上的標(biāo)本，2 h內(nèi)送檢。(5)肺組織標(biāo)本：用外科手術(shù)方法取適量標(biāo)本，2 h內(nèi)送檢。

1.4方法 采用2種微生物檢測方法，包括傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法和恒溫擴增芯片法，其中細(xì)菌培養(yǎng)法29例，基因芯片法104例，細(xì)菌培養(yǎng)法加基因芯片法1例。

1.4.1細(xì)菌培養(yǎng) 檢測標(biāo)本類型包括痰液、全血。痰標(biāo)本接種于血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，置于5%CO2、35 ℃培養(yǎng)24 h，若無病菌生長，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。厭氧/需氧血培養(yǎng)瓶置于3D全自動血培養(yǎng)儀進行培養(yǎng)，陽性報警瓶卸載后需進行涂片染色與轉(zhuǎn)種。在培養(yǎng)后的細(xì)菌平板中挑取單菌落制備為0.5麥?zhǔn)蠞舛葐挝坏木鷳乙?，使用Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定與藥敏分析儀及配套試劑進行鑒定與藥敏分析。

1.4.2恒溫擴增芯片法 檢測標(biāo)本類型包括咽拭子、痰液、灌洗液及肺組織。采用恒溫擴增技術(shù)對病原菌特異性靶基因進行擴增，1.5～2.5 h內(nèi)完成對呼吸道常見13種病原菌(肺炎鏈球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、嗜肺軍團菌)的檢測。按試劑盒說明書進行操作及結(jié)果判讀。

2 結(jié)果

2.1患者臨床基本資料 134例確診患者中，細(xì)菌檢測陽性者20例，陰性者114例。細(xì)菌檢測陽性組男9例，女11例；陰性組的男、女各57例。兩組患者的年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)菌檢測陽性組的危重癥患者比例和接受機械通氣治療的比例高于陰性組，且平均住院天數(shù)較長(P>0.05)。細(xì)菌檢測陽性組患者入住ICU的比例高于陰性組患者(P<0.05)，且陽性組的死亡率達15.0%，也顯著高于陰性組患者(P<0.05)。見表1。

表1 細(xì)菌檢測陽性者與陰性者的臨床基礎(chǔ)資料

2.2菌群組成、標(biāo)本類型 20例細(xì)菌檢測陽性患者中，16例患者均檢測到1種細(xì)菌，包括4例耐甲氧西林葡萄球菌、4例流感嗜血桿菌、3例肺炎克雷伯菌、2例鮑曼不動桿菌、2例嗜麥芽窄食單胞菌及1例金黃色葡萄球菌。4例患者檢測到2種細(xì)菌，包括2例肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌、1例肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌、1例耐甲氧西林葡萄球菌和大腸埃希菌。以上20例檢出者的標(biāo)本類型與檢測方法見表2。

表2 菌群組成、標(biāo)本類型及檢測方法

3 討論

目前研究表明，新型冠狀病毒肺炎合并細(xì)菌感染的發(fā)生率各有差異，統(tǒng)計結(jié)果不同主要由于各研究納入的普通型、重型、危重型患者比例有所差別。危重癥患者繼發(fā)細(xì)菌感染比例可達到普通型患者繼發(fā)細(xì)菌感染比例的3倍之多[3]，且發(fā)生繼發(fā)性細(xì)菌感染患者的死亡率遠高于非危重癥患者[4]。本研究結(jié)果表明，約15%的患者存在疑似細(xì)菌感染，疑似細(xì)菌感染者的ICU入住率和病死率顯著高于非細(xì)菌感染者?？傊?，新型冠狀病毒肺炎合并疑似細(xì)菌感染的發(fā)生率多數(shù)集中在10%～20%，低于以往的中東呼吸綜合征冠狀病毒、非典型肺炎病毒等合并細(xì)菌感染的發(fā)生率[5-6]。

在菌群分布方面，新型冠狀病毒肺炎合并疑似細(xì)菌感染位列前三位的菌種依次是肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林葡萄球菌及流感嗜血桿菌，與非典型肺炎病毒相比，耐甲氧西林葡萄球菌的感染率有所上升[7]。盡管臨床抗菌藥物治療在新型冠狀病毒肺炎患者中較為廣泛，但危重患者中疑似細(xì)菌感染的發(fā)生率及死亡率仍高居不下。一方面，非抗菌藥物相關(guān)危險因素，包括患者基礎(chǔ)疾病情況、糖皮質(zhì)激素治療、有創(chuàng)機械通氣、留置血管導(dǎo)管、入住重癥醫(yī)學(xué)科等，均為引起繼發(fā)性細(xì)菌感染的危險因素。因此，對有上述危險因素的患者應(yīng)格外注意動態(tài)監(jiān)測和接觸保護，對疑似細(xì)菌感染者應(yīng)結(jié)合臨床癥狀與實驗室指標(biāo)(包括降鈣素原水平)進行綜合分析[8]。另一方面，抗菌藥物相關(guān)危險因素，包括使用碳青霉烯類、頭孢菌素類、喹諾酮類、糖肽類抗菌藥物，聯(lián)合使用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，住院之前的抗菌藥物暴露，使用抗菌藥物的種類及時間等。第六版診療方案明確提出避免盲目或不恰當(dāng)使用抗菌藥物，尤其是聯(lián)合使用廣譜抗菌藥物。除此之外，還應(yīng)考慮抗菌藥物副作用與患者基礎(chǔ)疾病之間的關(guān)系，例如大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和喹諾酮類中的一些藥物可以延長心臟QT間期，對患有心臟疾病的患者可能會增加其死亡風(fēng)險，因此，抗菌藥物的治療效果與潛在風(fēng)險必須仔細(xì)權(quán)衡。

本研究納入的樣本總量有限，標(biāo)本多數(shù)為咽拭子，這可能低估或高估了新型冠狀病毒肺炎患者中疑似細(xì)菌感染的發(fā)生率，后續(xù)仍需多中心大樣本研究予以驗證。細(xì)菌培養(yǎng)法和基因芯片法的檢出結(jié)果只能說明樣本中存在相應(yīng)細(xì)菌，該菌是否為真正致病菌首先需要結(jié)合患者的臨床指標(biāo)和臨床表現(xiàn)進行綜合判斷，如白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白及發(fā)熱類型等，而病毒感染與細(xì)菌感染在這幾項指標(biāo)上均有不同甚至相反的表現(xiàn)，大大增加了確診細(xì)菌感染的難度。其次，要結(jié)合標(biāo)本類型及菌種類型進行判斷，如咽拭子和痰液標(biāo)本中常見的正常定植菌有甲型鏈球菌、卡他球菌、表皮葡萄球菌、乳桿菌等，若檢出肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等條件性致病菌且患者有細(xì)菌感染的癥狀，則可進行經(jīng)驗性抗菌藥物治療；而無菌部位如血液、灌洗液、肺組織中若檢出細(xì)菌則可考慮為致病菌。繼續(xù)監(jiān)測細(xì)菌檢出率及菌群分布變化將為臨床抗菌藥物的使用提供理論依據(jù)，對于提升危重癥患者的臨床救治率及進一步降低死亡率具有重要意義。