耿青青，田禎祥，張鶴鳴，王 宏，何 偉，劉雙妍

現(xiàn)有運動免疫學研究從血液和外周淋巴器官的免疫細胞入手探索運動性免疫失衡現(xiàn)象發(fā)生的原因，研究了運動過程中CD4+/CD8+倒置（陳佩杰 等，2011；Dong et al.，2011；Wang et al.，2011）、Th1/Th2漂移（肖衛(wèi)華 等，2011a，2011b；Wang et al.，2009）等現(xiàn)象，這些問題雖然表現(xiàn)在血液，但根源應在中樞淋巴器官骨髓及主要遷移區(qū)次級淋巴器官脾臟，即運動應激可能會在B淋巴細胞發(fā)育的不同階段，通過刺激分化因子、轉錄因子等調控因子（耿青青，2012，2013；耿青青 等，2011），影響B(tài)淋巴細胞發(fā)育過程中不同階段性的分化、增殖、發(fā)育和成熟。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)運動性免疫失衡現(xiàn)象的原因非常復雜，并非單一因素所造成，涉及免疫細胞之間的相互作用和整合作用（陳佩杰 等，2011；Wang et al.，2009），運動過程中會導致免疫細胞DNA損傷和細胞凋亡增多等現(xiàn)象（陳佩杰等，2011；耿青青，2012，2013；耿青青 等，2011；Dong et al.，2011），造成免疫失衡。

本研究遵循以上思路，從B淋巴細胞發(fā)育成熟的源頭骨髓及主要遷移區(qū)次級淋巴器官脾臟入手，探索B淋巴細胞受運動的影響所發(fā)生的數(shù)量和功能的改變，有助于闡明長期運動對B淋巴細胞發(fā)育成熟的影響以及機理。

隨著科研人員對骨髓分子生物學研究的深入，骨髓與骨微環(huán)境的形態(tài)學研究技術也在不斷優(yōu)化，如何使骨髓支架微結構及造血細胞群更加清晰易辨，這關系著骨微環(huán)境的重塑在實驗研究中的真實再現(xiàn)。Liu等（2017）采用振動法和低溫法處理樣品，探討了不同脫鈣劑對骨結構和抗原性的保護作用，得出10%中性緩沖EDTA和5%硝酸是組化染色的首選脫鈣劑，為制定適宜的大鼠脫鈣股骨骨組織分析方案提供了依據(jù)。

蘇木素-伊紅（H.E.）染色是組織病理學的主要染色之一，也是醫(yī)學診斷中應用最廣泛的染色之一。Fujii等（2016）選取了5例肺部API2-MALT1融合陽性MALT淋巴瘤進行石蠟切片，依次進行H.E.染色、CD79a免疫熒光染色等，研究顯示，腫瘤結構可能是對MALT淋巴瘤進行正確組織病理學診斷的核心因素，H.E.染色、免疫熒光染色等方法是細胞水平上實用且有效的病理學分析工具。

Laakko等（2002）研究在體植入小鼠體內相當于應激下的糖皮質激素含量36 h后，用流式細胞術方法觀察到淋巴系中的前祖B細胞減少20%；髓系干細胞中的粒細胞系增加了30%，紅細胞系、單核細胞系所占的百分比沒有顯著性變化，推測機體通過限制骨髓淋巴樣細胞的發(fā)育以保障機體的第一線免疫防御體系的能量供應。Trottier等（2012）和King等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，飲食導致肥胖的小鼠骨髓中髓系分支和淋巴系分支細胞均有增強，早期觀察發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)不良時，尤其是鋅元素缺乏時，機體通過減少淋巴系分支的發(fā)育以平衡有限的營養(yǎng)供應。

前期研究發(fā)現(xiàn)，運動性免疫失衡狀態(tài)下，B細胞早期發(fā)育中Pro B cell（原B細胞）階段的細胞數(shù)量明顯下降，Pre B cell（前B細胞）階段的細胞數(shù)量呈非常顯著性下降，不成熟B細胞呈顯著性下降，成熟B細胞則呈顯著性上升，提示6周遞增負荷運動可能通過代償機制，促使增殖池中僅存的少量前B細胞增殖和分化成為成熟B細胞，從而適應機體大量運動耗能的需要，這可能與骨髓中轉錄因子E2A、EBF、PAX5因子的表達相關（耿青青，2012，2013；耿青青 等，2011）。課題組一方面繼續(xù)從趨化因子如CXCL12、CXCL13、粘附因子、Notch信號家族等角度探索原因機制，另一方面，希望從形態(tài)學上得到B細胞發(fā)育的中樞器官骨髓和主要遷移區(qū)次級淋巴器官脾臟的圖像論據(jù)支持。

基于此，本研究在傳統(tǒng)脫鈣股骨骨髓組化技術的基礎上，對實驗流程進行改良，利用該實驗能夠使骨髓支架微結構及造血細胞群更加清晰易辨的特點，檢測遞增負荷運動過程中大鼠股骨骨髓、脾臟的組織結構變化及對骨髓B細胞早期發(fā)育的影響。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象分組、采樣與運動模型

選取64只8周齡雄性SD大鼠，隨機分為0周、2周、4周和6周組，每周數(shù)組又各分為實驗組和對照組，每組8只。大鼠進行6周遞增強度訓練，分別在0周、2周、4周和6周最后一次運動后48 h（消除上次運動的影響）采樣，無菌條件下取大鼠股骨和脾臟，有利于觀察隨著運動負荷的遞增，免疫功能所發(fā)生的適應性變化。

勻速跑臺運動，坡度設為0，每天訓練30 min，每周6天，共6周，經過1周的適應性訓練，第2周20 m/min起，速度每周遞增5 m/min，直至40 m/min。對照組正常喂養(yǎng)，不進行運動干預（耿青青，2012，2013）。

1.2 大鼠脫鈣股骨骨髓石蠟切片的制作及H.E.染色程序

1）股骨骨髓石蠟塊取材：在各采樣點無菌取出大鼠的一側股骨，迅速放入10%中性甲醛液中固定24 h，4℃10% EDTANa2脫鈣，搖床，每3天換液1次，1.5～2.0個月后，針刺無阻即判斷為脫鈣完成。用流動水沖洗8 h，取股骨骨干和股骨頭的結合部備用；2）脫水：60%乙醇1 h，70%、80%、90%、95%乙醇各2 h，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1 h；3）透明：正丁醇Ⅰ、Ⅱ依次各8 h和16 h。4）浸蠟：入蠟Ⅰ、Ⅱ各2 h，浸蠟溫度63℃～65℃，不得高于70℃；5）包埋：將組織放入包埋盒內，注入融化的石蠟，寫上標簽；6）切片：2～3 μm厚度連續(xù)切片；7）烤片：1.5 h，65℃；8）脫蠟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ依次各10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、95%、90%、80%、70%乙醇依次各1～2 min，水洗3 min，蒸餾水30 s；9）蘇木素染色1～2 min；10）流水沖洗反藍，蒸餾水洗；11）伊紅染色1～3 s，在鏡下控制分色程度，至細胞著色分明；12）蒸餾水速洗，吸水紙吸干；13）入95%乙醇分色1 min，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 大鼠脾臟石蠟切片的制作及H.E.染色程序

由于脾臟本身質地的原因，脾臟在固定液內固定后，若實驗試劑配制濃度及反應時間控制不當，極易引起固定后的脾臟變脆，導致切片標本有裂痕，甚至有脫片現(xiàn)象。

本研究將此方法改良，有效提高了制片的成功率：1）取材，4%甲醛固定24 h，流水沖洗8 h，切割成1～1.5 cm小塊備用；2）脫水：60%乙醇1 h，70%乙醇和80%乙醇各2 h，95% 乙醇 27 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ依次各9 min，7 min；3）透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ依次各9 min，7 min；4）浸蠟：入蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ依次各 16 min，18 min，20 min（浸蠟溫度 63℃～64℃）；5）包埋：做成蠟塊，寫上標簽；6）切片：2～3 μm的厚度；7）烤片：1.5 h，65℃；8）脫蠟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各9 min，10 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、95%乙醇各2 min，80%乙醇1 min，水洗3 min，蒸餾水30 s；9）～13）同脫鈣股骨骨髓切片染色程序。

1.4 脫鈣股骨骨髓、脾臟石蠟切片形態(tài)學觀察

隨機選取5個視野/切片，Image-pro PLUS 6.0圖像分析。骨髓H.E.切片觀察骨髓支架結構與造血細胞群；脾臟H.E.切片觀察紅髓、白髓、脾小結結構。

1.5 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計處理，結果采用平均數(shù)±標準差（M±SD）表示，通過單因素方差分析，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 大鼠體質量變化

各組大鼠體質量均有增長，均高于0周對照組，但各組間無顯著性變化（P＞0.05，表1）。

表1 大鼠體質量變化Table 1 Changes of Weights of Rats g

2.2 大鼠脾臟系數(shù)變化

與0周運動組相比，2周運動組呈非常顯著性下降（P＜0.01），4周運動組和6周運動組均呈顯著性下降（P＜0.05）；對照組各組間無顯著性差異（P＞0.05），排除了生長發(fā)育因素的影響（表2）。

表2 大鼠脾臟系數(shù)變化Table 2 Changes of Spleen Index of Rats

2.3 大鼠脫鈣股骨骨髓組織結構的變化

在6周遞增負荷運動過程中，0周運動組大鼠骨髓造血組織結構完整，造血細胞豐富，細胞群分布均勻，無分布定位異常。與0周運動組相比，2周運動組骨髓支架結構中造血細胞呈減少趨勢。與2周運動組相比，4周運動組骨髓支架結構中造血細胞有增加趨勢。與4周運動組相比，6周運動組骨髓支架結構中造血細胞有繼續(xù)增加趨勢，同時，與0周運動組相比，6周運動組細胞數(shù)量有增多趨勢（圖1）。脫鈣股骨骨髓石蠟切片半定量（吳迪等，2018）分析表明：骨髓網狀纖維化病理分級各組均為0級，未出現(xiàn)1級、2級和3級；骨髓造血細胞病理分級各組均為-級，各組造血細胞形態(tài)正常，分布均勻，造血組織結構完整，未出現(xiàn)病理+級，甚至++級和+++級。

圖1 各周運動組大鼠脫鈣股骨骨髓石蠟切片H.E.染色圖（40×10倍）Figure 1. H.E.of Paraffin Section of Decalcified Femur Bone Marrow in Exercise Group

2.4 大鼠脾臟組織結構的變化

顯微鏡下可見大鼠脾臟被膜、紅髓、白髓和脾小結。大鼠脾臟被膜較薄。白髓H.E.染色呈紫色，紅髓呈粉紅色。白髓中央或一側有中央動脈。當白髓結構完整典型時，脾小結清晰可見，大小不一，形狀各不相同。紅髓內還可見許多紅細胞。

在0周運動組，白髓和紅髓之間界線清楚，脾小結比較明顯；2周運動組白髓和紅髓之間界線不清晰，脾小結模糊；4周運動組仍呈現(xiàn)白髓和紅髓界線交叉現(xiàn)象，界線模糊，白髓開始呈現(xiàn)減少趨勢，脾小結模糊不清；6周運動組，白髓結構相對比較集中，但出現(xiàn)紅髓浸潤到白髓結構中的現(xiàn)象，脾小結模糊（圖2）。H.E.染色半定量（劉玲玲等，2012）分析表明，0周、2周、4周和6周的脾組織病理分級分別為-、+、+、-，尚未出現(xiàn)病理++級和+++級。

圖2 各周運動組大鼠脾臟H.E.染色圖（40×10倍）Figure 2. H.E.of Spleen in Exercise Group

3 分析與討論

3.1 長期遞增負荷運動中骨髓切片結構的改變

功能的變化源于結構的變化。骨髓和脾臟這兩個重要的B細胞發(fā)育中樞和主要遷移區(qū)次級淋巴器官，維持其正常的形態(tài)和結構是保障免疫功能正常運作的前提和先決條件。鑒于此，觀察6周遞增負荷運動中大鼠骨髓和脾臟結構的變化，研究其對B淋巴細胞發(fā)育早期的影響，對于揭示運動性免疫失衡機制具有重要意義。

本研究遵循這個思路，從B淋巴細胞發(fā)育成熟的源頭骨髓和次級淋巴器官脾臟，探索B淋巴細胞受運動的影響所發(fā)生的數(shù)量、功能的改變，不僅有助于闡明長期運動對B淋巴細胞發(fā)育成熟的影響以及機理，還為運動性免疫失衡的調理提供新的方法、思路和圖像依據(jù)。

本研究采用的脫鈣股骨骨髓組化技術鮮見報道，與骨髓涂片相比，該方法可以使骨髓支架微結構及造血細胞群更加清晰易辨，更利于髓內組織構形的保存（Clay-combe et al.，2016；Hardy et al.，2012）。因為脫鈣是骨組織病理學觀察和含骨組織（Ma et al.，2016）的重要步驟，目前脫鈣方法普遍操作繁瑣，因此，樣品的脫鈣處理環(huán)節(jié)對骨微環(huán)境重塑的真實再現(xiàn)至關重要。本研究采用4℃低溫處理、10%EDTANa2低脫鈣溶液和搖床方式連續(xù)性地晃動樣品，有助于高效脫鈣和保存石蠟包埋切片樣品的組織結構和抗原性（圖1）。

骨髓是造血組織，也是各類免疫細胞的發(fā)生場所。骨髓中含有骨髓基質細胞（stromal cell）和造血干細胞（hematopoietic steam cells，HSC）（Abdelrasoul et al.，2018）。HSC具有多種分化潛能，因此又稱多能HSC（plu-ripotent HSC）。出生后以及整個成年期，多能HSC一般僅見于骨髓。多能HSC分為淋巴樣干細胞（lymphoid stem cell）和髓樣干細胞（myeloid stem cell）兩大類。髓樣干細胞可繼續(xù)分化為具有產生粒細胞系、紅細胞系、巨核細胞系和單核-吞噬細胞系潛能的集落形成單位CFU-GEMM（Abdelrasoul et al.，2018）。淋巴樣干細胞可繼續(xù)分化為B細胞、T細胞和NK細胞，在此過程中，有眾多轉錄因子（如EBF）、細胞分化因子（如IL-7）、趨化生長因子（如CX-CL-12）、Notch信號家族等參與調控，它們啟動不同譜系特異基因的表達，以確保淋巴樣干細胞向某一譜系（如B淋巴細胞）分化時，也將失去向其他譜系分化的潛能。淋巴樣干細胞中的一部分在骨髓內繼續(xù)分化成B細胞，主要包括前祖B細胞（pre-pro B cell）、原（祖）B細胞（pro-B cell）、前B（祖）細胞（pre-B cell）、不成熟B細胞（immature B）、成熟B細胞（mature B）。B淋巴細胞大約在骨髓發(fā)育20 d成熟時穿過血竇壁進入血流。其遷出骨髓，先進入脾臟，往往在脾臟接觸抗原后再遷移到其他次級淋巴器官（Abdelrasoul et al.，2018）。

運動狀態(tài)下，神經-內分泌-免疫軸會發(fā)生變化，抵抗或適應運動應激，免疫系統(tǒng)也會發(fā)生變化，最終使機體盡可能保持相對平衡的內穩(wěn)態(tài)（Dela et al.，2016；Radom et al.，2016；Yamanaka et al.，2010）。中樞骨髓造血干細胞、造血祖細胞等幼稚細胞和造血調控因子的改變，會引發(fā)外周血細胞形態(tài)、功能和數(shù)量改變，而免疫細胞數(shù)量的變化則可反映免疫失衡的發(fā)展進程和嚴重程度。骨髓造血微環(huán)境中細胞與細胞之間、細胞與基質之間以及細胞與細胞因子之間的相互作用，造血細胞自我更新與分化之間的平衡，精確地調控著骨髓中免疫細胞的損傷與修復（浦權，2002）。骨髓作為中樞淋巴器官，為免疫細胞提供了適宜存活和增殖的微環(huán)境，研究脫鈣股骨骨髓形態(tài)結構的變化，對于了解機體的B細胞早期發(fā)育具有重大參考價值。

本研究通過觀察脫鈣股骨骨髓石蠟包埋組織切片發(fā)現(xiàn)，2周運動組骨髓造血細胞數(shù)量呈減少趨勢，可能是機體受到驟然升高的運動強度，機體免疫機能保護性應答反應過度而產生；4周、6周運動組造血細胞呈增加趨勢，可能是骨髓髓系干細胞在隨著訓練周數(shù)的遞進，對遞增的運動強度有了更加節(jié)約化的適應性免疫反應。由于機體營養(yǎng)供應分配有優(yōu)先等次之分，會引起骨髓髓系與淋巴系細胞增殖情況發(fā)生變化（King et al.，2002；Laakko et al.，2002；Trottier et al.，2012）：骨髓增殖池中髓系干細胞的數(shù)量變化影響著淋巴系細胞凋亡的數(shù)量變化以及增殖情況的抑制或促進。這些骨髓造血微環(huán)境的改變一定會影響B(tài)淋巴細胞在骨髓的早期分化與發(fā)育（耿青青，2012，2013；耿青青 等，2011）。

已有研究表明（盧興國，2008），免疫失衡狀態(tài)下，骨髓各造血細胞所受影響各不相同，細胞的半衰期越短越易受影響而發(fā)生凋亡。白細胞的半衰期為6 h，血小板5～7天，紅細胞則長至127天，因此白細胞受影響最大，特別是粒細胞減少最為明顯，即白細胞數(shù)量對骨髓造血微環(huán)境的變化更為敏感。研究還發(fā)現(xiàn)，骨髓中B淋巴細胞數(shù)量減少不僅是因為發(fā)育中細胞數(shù)量的減少，還與存活細胞增殖能力的減弱有關（Nunez et al.，1990；Juan et al.，2011）。Laakko等（2002）模擬了運動應激下的體內皮質酮（corticosterone），不僅造成小鼠骨髓中原B細胞、前B細胞的數(shù)量百分比大幅下降，且存活下來的原B細胞和前B細胞的增殖能力也會急劇下降。

3.2 長期遞增負荷運動中脾指數(shù)與脾臟微結構的改變

脾是機體最大的外周淋巴器官，具有濾血和產生免疫應答等重要功能。白髓是一個密集的淋巴組織，分布在中央靜脈周圍，由動脈周圍淋巴鞘和脾小結組成。動脈周圍淋巴鞘由大量T細胞等組成，是脾臟中的胸腺依賴區(qū)，當發(fā)生免疫應答時，此區(qū)明顯增厚（成令忠，2003）。脾小結主要由B細胞組成。紅髓由脾索和脾血竇組成。白髓結構典型與否和機體受到的抗原刺激有關。隨著抗原刺激的不斷增加，免疫反應不斷增強，脾小結中含有活躍的B細胞，移行區(qū)則被用作脾臟與血液淋巴細胞再循環(huán)的通道，其在動員具有免疫活性的淋巴細胞方面發(fā)揮重要作用。隨著白髓與紅髓界線漸漸模糊，白髓比例降低，脾小結逐漸不明顯，預示著免疫能力逐漸下降，因此，脾臟的組織學變化代表了機體免疫功能的改變。

脾也是機體發(fā)生免疫功能的重要場所，脾指數(shù)的高低在一定程度上反映了身體免疫機能的強弱。本文同時檢測了脾指數(shù)和脾臟切片H.E.染色兩項指標，既可以相互補充，又可以相互論證：脾臟切片顯示，從2周運動組開始出現(xiàn)白髓和紅髓之間界線交叉現(xiàn)象；6周運動組，出現(xiàn)了紅髓浸潤到白髓結構中的現(xiàn)象；與0周運動組相比，脾指數(shù)在2周運動組呈非常顯著性下降，4周運動組和6周運動組呈顯著性下降。

綜上，提示脾臟免疫機能下降，推測可能是在訓練進程的第2周，運動負荷驟升，機體免疫系統(tǒng)對此“不適應”應激，產生了一種過表達方式的應答初反應。4周和6周，在運動負荷的不斷遞加的情況下，伴隨著運動性疲勞的累積等，誘導機體產生過多活性氧，這會對淋巴細胞DNA造成損傷，改變淋巴細胞的生物學活性，如削弱細胞的增殖能力，分泌功能等，也會加速免疫細胞的凋亡甚至死亡（陳佩杰 等，2011；耿青青，2013；耿青青 等，2011），可能會進一步誘發(fā)外周肌肉組織炎性因子浸潤的發(fā)生（陳佩杰 等，2011）。

脾臟和淋巴結都是機體的外周免疫器官，是成熟T細胞和B細胞駐留、增殖以及對抗原刺激作出反應的場所，這些器官富含捕捉和處理抗原的巨噬細胞和樹突細胞，后者又能迅速捕獲和處理抗原，并將處理后的抗原遞呈給免疫活性細胞，主要是T細胞和B細胞。T細胞和B細胞經骨髓分化發(fā)育成熟后，經血液循環(huán)分布到外周免疫器官。B細胞主要分布在脾臟的脾小結、脾索和脾淋巴鞘外周，以及淋巴結的淋巴小結、髓索和胃腸道黏膜下的淋巴小結中（陳海英，2008）。本研究通過觀察脾臟組織切片可知，由2周組紅髓和白髓界限不清，到6周組紅髓與白髓有浸潤現(xiàn)象發(fā)生，提示遞增負荷運動應激下，大鼠脾臟B淋巴細胞數(shù)量有減少趨勢。有研究顯示，脾臟淋巴細胞的大量凋亡必然導致免疫細胞的損耗以及凋亡細胞本身所產生對免疫系統(tǒng)的抑制（Kennedy et al.，2017），這將進一步削弱脾臟B細胞的增殖能力，加速脾臟B細胞凋亡，進而導致脾臟免疫機能下降。

骨髓作為中樞淋巴器官，脾臟作為次級淋巴器官，對比表明，與骨髓微環(huán)境相比，脾臟微結構發(fā)生的免疫反應對運動應激更為敏感，其變化也比骨髓更加明顯；兩者適應性反應也各不相同。這些組織微結構的變化為運動性免疫失衡的分子生物學討論（圖3）提供了有力的圖像論證支持，奠定了組織學基礎。

圖3 實驗各指標在2周組的變化及相互關聯(lián)Figure 3. Changes and Correlations of Indexes in 2-Week Group

4 小結

與0周運動組相比，2周運動組脫鈣股骨骨髓造血細胞呈下降趨勢，4周組和6周組呈上升趨勢，推測：隨著訓練周數(shù)的推進，骨髓中淋巴系干細胞與髓系干細胞生發(fā)比例會發(fā)生改變，因為機體營養(yǎng)供應，對于髓系與淋巴系的分配是不同步且有優(yōu)先等次之分，那么骨髓增殖池中髓系干細胞的數(shù)量變化，影響著淋巴系細胞的凋亡和增殖情況，進而影響B(tài)淋巴細胞在骨髓的早期發(fā)育。

從2周運動組開始出現(xiàn)白髓和紅髓之間界線交叉現(xiàn)象，同時脾指數(shù)明顯下降，提示脾臟免疫機能下降，可能是伴隨著運動性疲勞的累積，削弱了脾臟免疫細胞的增殖與活化能力，進而影響了B淋巴細胞在脾臟的進一步分化與發(fā)育。

綜上，提示與骨髓微環(huán)境相比，脾臟微結構的免疫反應對運動應激更為敏感，其變化比骨髓更加明顯；兩者適應性反應大不相同。