陳曉文，朱浩，吳飛華，原永芳（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 200011）

嬰幼兒血管瘤是兒童最常見的良性腫瘤，目前公認(rèn)的一線治療藥物是口服非選擇性β受體阻滯劑普萘洛爾，但其存在全身不良反應(yīng)，包括心動(dòng)過緩、低血壓、支氣管痙攣等，且口服普萘洛爾肝臟首過效應(yīng)強(qiáng)，個(gè)體差異大[1]，繼而有研究外用普萘洛爾用于面積小、位置表淺的血管瘤患兒[2]。噻嗎洛爾與普萘洛爾同屬非選擇性β受體阻滯劑，其作用強(qiáng)度為普萘洛爾的8 倍，無內(nèi)源性擬交感活性，無直接抑制心臟作用。2010年有報(bào)道局部外用馬來酸噻嗎洛爾眼藥水治療眼瞼血管瘤有效，可以使治療藥物噻嗎洛爾富集于病灶部位發(fā)揮作用并且明顯減少藥物對(duì)全身的影響，更為安全，尤其適合于面部和眼周區(qū)域的淺表型病灶[3-4]。但目前國內(nèi)尚無商品化的噻嗎洛爾凝膠制劑[5]，市售馬來酸噻嗎洛爾滴眼劑使用不方便，且存在敷藥后易蒸發(fā)，劑量不容易掌握，長期使用會(huì)致皮膚干燥、脫皮等缺陷，不利于臨床使用[6]。為此，本院自行研制了血管瘤乳膏，含0.5%馬來酸噻嗎洛爾，適用于嬰幼兒血管瘤。為更好地對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，參考《中國藥典》2020年版采用紫外分光光度法作為馬來酸噻嗎洛爾制劑中噻嗎洛爾含量的測(cè)定方法[7]，并選取紫外分光光度法中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法（298 nm）、吸收系數(shù)法（298 nm）、雙波長法（測(cè)定波長298 nm、參比波長330 nm）、一階導(dǎo)數(shù)法（316 nm）對(duì)血管瘤乳膏中馬來酸噻嗎洛爾的含量定量分析進(jìn)行了方法學(xué)考察。

1 材料

1.1 儀器

紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；電子分析天平（德國Sartorius 公司，d ＝0.1 mg）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試藥

馬來酸噻嗎洛爾（天津市中央藥業(yè)有限公司，批號(hào)：180301，純度：99.9%），血管瘤乳膏（規(guī)格：20 g/0.1 g，批號(hào)：190410、190430、190507）及不含噻嗎洛爾的空白乳膏均為院內(nèi)自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱定經(jīng)105℃干燥至恒重的馬來酸噻嗎洛爾，加乙醇振搖溶解后，定量配制成質(zhì)量濃度為20 μg·mL－1的對(duì)照品溶液，即得。

2.2 樣品溶液的配制

精密稱取血管瘤乳膏1 g，加適量乙醇水浴振搖溶解，置冰箱中冷卻30 min。過濾，濾液用乙醇定容至50 mL 量瓶。再精密量取10 mL 至50 mL 量瓶中，加乙醇至刻度，即得。

2.3 乳膏基質(zhì)溶液的配制

按照血管瘤乳膏處方及工藝配制不含馬來酸噻嗎洛爾的空白乳膏。精密稱取空白乳膏1 g，按“2.2”項(xiàng)下方法處理，即得。

2.4 測(cè)定波長的選擇

以乙醇為空白，在250～350 nm 波長內(nèi)對(duì)上述3 種溶液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖1，可見馬來酸噻嗎洛爾在298 nm 波長處有最大吸收，而乳膏基質(zhì)在此處無吸收，不干擾主分的測(cè)定。

圖1 3 種溶液的吸收光譜圖Fig 1 Absorption spectra of 3 dilutions

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將對(duì)照品溶液避光放置于冰箱，分別于0、1、2、3、5、24 h 時(shí)測(cè)定吸收度，RSD為0.30%（n＝6），說明馬來酸噻嗎洛爾乙醇溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 方法的選擇[8]

精密稱定經(jīng)105℃干燥至恒重的馬來酸噻嗎洛爾20 mg，置200 mL 量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1.0、2.0、2.5、3.0、3.5 和4.0 mL 分別置10 mL 量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。

2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 以乳膏基質(zhì)溶液為空白，照分光光度法在298 nm 波長測(cè)定吸收度，繪制吸收度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A＝0.0215C＋1.714×10－3，r＝0.9999，線性范圍為10～40 μg·mL－1，見表1。

2.6.2 吸收系數(shù)法 根據(jù)朗伯-比爾定律，由公式A＝ECL 得出馬來酸噻嗎洛爾的紫外吸收系數(shù)E1%1cm，取平均吸收系數(shù)215，RSD為0.98%，見表1。

表1 馬來酸噻嗎洛爾的紫外吸收系數(shù)Tab 1 Absorption coefficient of timolol maleate

2.6.3 雙波長法[9]由于馬來酸噻嗎洛爾在298 nm 波長處有最大吸收，乳膏基質(zhì)溶液在298、330 nm 波長處有相同吸收度，且馬來酸噻嗎洛爾兩波長處的吸光度差值足夠大，所以298、330 nm 可作為雙波長法的測(cè)定波長和參比波長。以乙醇為空白，在298、330 nm 波長處測(cè)定吸收度，繪制吸收度差值-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A（298～330）＝0.0191C＋3.629×10－3，r＝0.9999，濃度線性范圍為10～40 μg·mL－1，見表2。

2.6.4 一階導(dǎo)數(shù)法 對(duì)圖1進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)轉(zhuǎn)換，可見在一階導(dǎo)數(shù)圖譜中316 nm 波長處，乳膏基質(zhì)溶液的振幅Z為0，對(duì)照品溶液與樣品溶液在此波長處振幅最大且相似，此波長處乳膏基質(zhì)對(duì)測(cè)定無干擾，見圖2。故以316 nm 作為一階導(dǎo)數(shù)測(cè)定波長，以此波長處的振幅Z值作為定量依據(jù)。以乙醇為空白，以316 nm 為一階導(dǎo)數(shù)測(cè)定波長，繪制振幅值-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Z316＝－8.422C＋6.571×10－4，r＝0.9994，線性范圍為10～40 μg·mL－1，見表2。

圖2 3 種稀釋液的一階導(dǎo)數(shù)光譜圖Fig 2 First derivative spectra of three dilutions

表2 馬來酸噻嗎洛爾的紫外光譜數(shù)據(jù)Tab 2 UV spectrum data of timolol maleate

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 回收試驗(yàn) 精密稱取105 ℃干燥至恒重的馬來酸噻嗎洛爾，按處方量分別配制相當(dāng)于標(biāo)示量為80%、100%、120%的樣品溶液，各3 份，按“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行紫外分光光度法測(cè)定，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線法平均回收率為96.8%，RSD為2.0%；吸收系數(shù)法平均回收率為97.1%，RSD為2.1%；雙波長法平均回收率為96.1%，RSD為2.3%；一階導(dǎo)數(shù)法平均回收率為94.6%，RSD為4.3%。4 種方法均符合藥物質(zhì)量控制分析方法的要求。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 將“2.7.1”項(xiàng)下配制的100%樣品溶液，于同一日內(nèi)每批測(cè)定5 次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線法、吸收系數(shù)法、雙波長法、一階導(dǎo)數(shù)法日內(nèi)精密度RSD分別為1.6%、1.6%、1.6%、0.0%；日間精密度RSD分別為2.2%、2.6%、1.3%、0.0%。

2.8 樣品含量的測(cè)定

按照“2.6”項(xiàng)下方法，分別測(cè)定3 個(gè)批次樣品中馬來酸噻嗎洛爾含量，結(jié)果見表3。4 種方法均可對(duì)血管瘤乳膏中馬來酸噻嗎洛爾進(jìn)行定量測(cè)定。

表3 4 種方法測(cè)定3 批樣品含量結(jié)果比較Tab 3 Content determination of 3 batches of samples by 4 methods

3 討論

血管瘤乳膏為本院自制制劑，用于嬰幼兒血管瘤的治療，彌補(bǔ)了無市售噻嗎洛爾凝膠或乳膏制劑的不足。血管瘤乳膏中馬來酸噻嗎洛爾含量對(duì)治療效果影響很大，故建立血管瘤乳膏中馬來酸噻嗎洛爾的含量測(cè)定方法尤為重要。

馬來酸噻嗎洛爾在乙醇中略溶，且測(cè)定波長選擇在298 nm、316 nm 及330 nm，均大于乙醇截止使用波長，符合紫外-可見分光光度法對(duì)溶劑的要求。

紫外分光光度法根據(jù)樣品的吸光度對(duì)波長的變化規(guī)律來進(jìn)行定性和定量分析，應(yīng)用紫外分光光度法對(duì)共存組分進(jìn)行不分離定量測(cè)定時(shí)，通常采用的方法有雙波長法、三波長法、導(dǎo)數(shù)光譜法等，筆者選擇使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法、吸光系數(shù)法、雙波長法、一階導(dǎo)數(shù)法分別對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果，4 種測(cè)定方法回收率、精密度都在可控范圍內(nèi)，符合藥物含量測(cè)定要求，均可用于血管瘤乳膏中馬來酸噻嗎洛爾的含量測(cè)定。

由于受乳膏基質(zhì)吸收的影響，在進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法及吸收系數(shù)法要扣除空白乳膏基質(zhì)的吸收才能進(jìn)行計(jì)算，每次需另行配制空白乳膏并制備乳膏基質(zhì)溶液，操作繁瑣。雙波長法利用測(cè)定波長和參比波長的差值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以同時(shí)測(cè)定互有干擾的兩個(gè)組分，消除空白輔料的干擾，方便簡潔。一階導(dǎo)數(shù)法采用微分求導(dǎo)，可以在譜圖上顯示出微小的變化，不僅具有雙波長法測(cè)定的上述優(yōu)點(diǎn)，而且可以提高光譜圖的分辨率，具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、操作方便、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的優(yōu)越性。