馮文，劉峰，謝華（四川省藥品檢驗研究院，成都 611731）

利巴韋林（ribavirin）又名病毒唑、三氮唑核苷等，化學名為1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-羧酰胺（結構式見圖1），是廣譜強效的抗逆轉錄病毒藥物[1-2]，屬合成核苷類藥，對多種DNA 和RNA 病毒有抑制作用，具有作用位點多、不易產(chǎn)生耐藥性、療效高、毒性低和不良反應少等特點，現(xiàn)已用于多種病毒的治療。

有關物質的考察貫穿于整個藥品研究，直接關系到制劑質量的可控性與安全性。利巴韋林滴眼液的有關物質測定方法未見報道，國內外藥典雖收載其原料藥的有關物質檢測方法[3-6]，但由于滴眼液中抑菌劑等特殊輔料[7]（如羥苯乙酯）與利巴韋林極性差異較大，利巴韋林原料藥的有關物質測定方法無法及時將其洗脫，連續(xù)進樣多針后殘留物將干擾后續(xù)樣品的測定。因此，本文建立了一種測定利巴韋林滴眼液中主要降解雜質A（結構式見圖1）及其他有關物質的方法，以消除滴眼液中特殊輔料的干擾，為其質量提供了可靠的檢測依據(jù)，也為本品研發(fā)、生產(chǎn)和質量提升提供分析方法。

圖1 利巴韋林雜質A 與利巴韋林化學結構式Fig 1 Chemical structure formula of impurity A and ribavirin

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Agilent 1100（安捷倫科技有限公司）；高效液相色譜儀島津LC20A（島津實驗器材有限公司）；電子天平（賽多利斯Sartorius CPA255D，十萬分之一）。

利巴韋林滴眼液[A 企業(yè)3 批次；B 企業(yè)15批次；C 企業(yè)2 批次；D 企業(yè)2 批次；E 企業(yè)6 批次；F 企業(yè)15 批次；G 企業(yè)14 批次；H 企業(yè)5 批次；I 企業(yè)3 批次；J 企業(yè)14 批次；K 企業(yè)17 批次（其中批號為20010401 樣品用于方法學驗證）]。利巴韋林對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：140629-201703，含量：99.60%），利巴韋林雜質A（TLC，批號：3793-019A1，含量：100%），空白輔料由各企業(yè)提供。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品適量，用水稀釋制成每1 mL 中約含利巴韋林0.5 mg 的溶液，作為供試品溶液。

2.1.2 對照品儲備液的制備 分別精密稱取利巴韋林對照品與雜質A 對照品各約10 mg，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得利巴韋林對照品儲備液與雜質A 對照品儲備液。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密量取利巴韋林對照品儲備液與雜質A 對照品儲備液各2.5 mL，置同一100 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.1.4 對照溶液的制備 精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適用性溶液 取供試品溶液5 mL，加入1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液5 mL，靜置30 min，用5 mL 1 mol·L－1的鹽酸溶液中和，以產(chǎn)生雜質A 溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.1.6 空白輔料溶液配制 由于各企業(yè)處方不同，空白輔料溶液是11 家企業(yè)所用所有輔料的混合溶液。即精密稱取氯化鈉0.9 g、硼酸0.95 g、硼砂50 mg、羥苯乙酯40 mg、苯扎溴銨10 mg、甘油1.0 g 置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL 置10 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱Waters Atlantis T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.1%硫酸鈉水溶液（取無水硫酸鈉1.0 g，加水950 mL 溶解，加2 mL5%磷酸，用5%磷酸調節(jié)pH 至2.8，用水稀釋至1000 mL，即得）為流動相A，以乙腈-流動相A（5∶95）為流動相B，以20%乙腈為流動相C，以乙腈為流動相D；流速為1.0 mL·min－1；按表1進行梯度洗脫；柱溫為30℃；檢測波長為220 nm；進樣體積為20 μL。系統(tǒng)適用性溶液中，雜質A（相對保留時間約0.78）與利巴韋林分離度應不低于4.0。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.3 專屬性考察

精密量取空白輔料溶液、系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液各20 μL 進樣，記錄色譜圖（見圖2）。空白輔料對本品有關物質的測定無干擾，各雜質與主成分分離良好，方法專屬性良好。

圖2 系統(tǒng)適用性溶液圖譜Fig 2 HPLC chromatogram of system suitability solution

2.4 強制降解試驗

為考察在所選擇的色譜條件下能否檢出利巴韋林滴眼液中可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，分別用高溫、酸、堿、氧化和光照等劇烈條件對本品進行破壞，試驗如下：

① 未破壞溶液：精密量取本品5 mL，置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

② 酸破壞：精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，加1 mol·L－1鹽酸溶液2 mL，靜置120 min，用等濃度氫氧化鈉溶液中和，加水稀釋至刻度作為酸破壞溶液；同法配制酸空白溶液及酸破壞輔料溶液。

③ 堿破壞：精密量取本品5 mL，置10 mL 量瓶中，加1 mol·L－1氫氧化鈉溶液2 mL，靜置60 min，用等濃度鹽酸溶液中和，加水稀釋至刻度作為堿破壞溶液；同法配制堿空白溶液及輔料溶液。

④ 高溫破壞：精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，密封，于105℃加熱8 h 作為高溫破壞溶液；同法配制高溫輔料溶液。

⑤ 光照破壞：取本品適量，5000 Lx 光照射5 d，取破壞后樣品5 mL，置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；同法配制光照輔料溶液。

⑥ 氧化破壞：精密量取本品5 mL，置10 mL 量瓶中，加入30%過氧化氫溶液2.0 mL，靜置60 min，用水稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液；同法配制氧化空白溶液及輔料溶液。

取上述溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜儀，結果見圖3。由強制降解試驗結果可知，本品在光照條件下相對比較穩(wěn)定；在酸、堿和高溫條件下主要破壞產(chǎn)生雜質A，其中在堿性條件下破壞產(chǎn)生的雜質A 最多；在氧化條件下破壞出雜質峰個數(shù)最多，保留時間約為5.5 min 和17 min 的雜質有明顯增加。破壞試驗中各雜質峰與利巴韋林峰分離良好，無其他雜質峰干擾已知雜質的測定，能有效檢出雜質，表明該色譜方法專屬性良好。

圖3 強制降解試驗色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of forced degradation test

2.5 線性試驗

精密量取“2.1.2”項下對照品儲備液適量，用水稀釋制成含利巴韋林和雜質A 的質量濃度分別約為0.25、0.5、2.5、5.0、10.0、15.0 μg·mL－1的系列濃度的對照品溶液。精密量取系列濃度的對照品溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以質量濃度作為橫坐標，峰面積作為縱坐標，繪制標準曲線，見表2。

表2 利巴韋林和雜質A 的回歸方程、范圍、檢測限和定量限Tab 2 Linearity，regression equation，LOQ and LOD of ribavirin and impurity A

2.6 檢測限、定量限

將線性溶液（15 μg·mL－1）逐步稀釋后進樣測定，以色譜圖中信噪比（S/N）為3∶1 確定檢測限，S/N為10∶1 確定定量限，結果見表2。

2.7 進樣精密度

精密吸取對照品溶液與對照溶液各20 μL，按“2.2”項下色譜條件測定6 次，記錄色譜圖，考察進樣精密度，結果利巴韋林與雜質A 連續(xù)6針峰面積RSD分別為0.3%和0.4%，表明本法進樣精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性

精密吸取對照品溶液、對照溶液與供試品溶液各20 μL，按“2.2”項下色譜條件分別在常溫下于0、2、4、6、10、24 h 進樣，記錄色譜圖，結果主成分及雜質A 峰面積RSD均小于2%，也無其他雜質產(chǎn)生，表明各溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.9 準確度

按照各企業(yè)提供的處方及輔料對試藥進行混合，得到多組分多廠家共用空白輔料，添加相應的利巴韋林對照品（雜質均未檢出），作為陰性樣品，稱取陰性樣品適量（約相當于利巴韋林5 mg），共9 份，分別置10 mL 量瓶中，再分別精密加入對照品儲備液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，加流動相適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為準確度試驗80%、100%、120%的供試品溶液，按照擬訂的色譜條件檢測。結果雜質A 的回收率在94.6%～100.3%，RSD均＜2.0%，表明該方法準確度較高。

2.10 重復性

精密量取本品適量，用水定量稀釋制成每1 mL 中約含利巴韋林0.5 mg 的溶液，作為供試品溶液，平行制備6 份，按“2.2”項下方法測定，已知雜質A 按外標法以峰面積計算含量，未知雜質按自身對照法以峰面積計算含量，結果顯示，雜質A的RSD為4.1%，最大未知單雜RSD為3.3%，總雜RSD為4.1%，表明方法重復性良好。

2.11 雜質校正因子

在兩臺液相色譜儀（Agilent 1100 高效液相色譜儀和島津LC20A 高效液相色譜儀）上，考察3 根色譜柱[型號分別為：Waters Atlantis T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry Shield C18（4.6 mm×150 mm 5 μm）、YMC-Triart C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）]，分別進樣“2.5”項下線性溶液，以各成分進樣量對峰面積進行回歸，用利巴韋林斜率除以雜質A 斜率測得雜質A 相對校正因子的平均值為2.0，為雜質A 的準確定量提供了經(jīng)濟便捷的計算方式。

2.12 耐用性

為考察本方法對條件發(fā)生微小變化的耐受程度，進行耐用性試驗，改變因素包括流動相比例±2%、流速變化±10%、柱溫變化±10%。以含有3 種已知雜質A 的樣品（D 企業(yè)，批號20010401）為耐用性試驗溶液，考察條件改變對測定結果的影響。經(jīng)測定，在上述各條件下雜質A 與主成分之間分離度良好，測得雜質A 的RSD分別為3.4%，最大未知單雜RSD為4.5%，總雜RSD為3.3%，表明方法耐用性良好。

2.13 樣品測定

按“2.3”項下方法測定11 個不同生產(chǎn)企業(yè)共96 批利巴韋林滴眼液中的有關物質，結果見表3。

表3 利巴韋林滴眼液有關物質檢查結果Tab 3 Determination of related compounds in ribavirin eyes drops

2.14 限度

參照《中國藥典》2020年版利巴韋林原料及其注射液的限度，同時考慮本品的臨床使用情況，擬定有關物質限度為：供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，除輔料峰外，雜質A 按校正后的峰面積計算（乘以校正因子2.0）不得大于對照溶液主峰面積的0.5 倍（0.5%）；其他單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.5 倍；各雜質校正后峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積（1.0%）。

2.15 未知雜質的定性研究

K 企業(yè)17 批樣品均合格，其中最大未知單雜均為相對保留時間約1.9 的雜質，檢出量為利巴韋林標示量的0.32%～0.44%，其他10 家生產(chǎn)企業(yè)樣品中未檢出該雜質。采用2D-HPLC-DADESI-Q-TOF 技術[一維液相條件同本文建立的色譜條件；二維液相條件為：采用中心切割，色譜柱為Agilent EclipsePlus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相為以0.1%甲酸水溶液為流動相A，以甲醇為流動相B，梯度洗脫（0～17.6 min，95%A；17.6～23 min，95%→5%A；23～35 min，5%A），流速為0.3 mL·min－1，檢測波長為220 nm；質譜條件為：采用ESI 源，質譜掃描范圍為100～1000m/z，負離子模式，Gas Temp：325℃，Drying Gas：8 L·min－1，VCap：3500 V，Expt：1000 V]。推測降解反應機制，將K 企業(yè)樣品（批號：20010401）105℃加熱8 h 進行分析，結果見圖4。

圖4 未知雜質（相對保留時間約1.9）的一維液相色譜圖（A）和質譜圖（B）Fig 4 One-dimensional liquid chromatogram（A）and MS1（B）of unknown impurity（relative retention time about 1.9）

根據(jù)質譜結果，相對保留時間約為1.9 的雜質m/z為200.9832[M-H]－，推測其為硫柳汞鈉與氯化鈉配伍所產(chǎn)生[8-10]，反應機制為：硫柳汞鈉在氯化鈉存在的條件下，可分解為硫代水楊酸和氯化乙基汞，硫代水楊酸不能穩(wěn)定存在，經(jīng)氧化生成較為穩(wěn)定的2，2'-二硫代二苯甲酸。2，2'-二硫代二苯甲酸在乙基汞的作用下，部分分解轉化為硫柳汞鈉，部分經(jīng)三步氧化，最終轉化為2-磺基苯甲酸（見圖5）。

圖5 2-磺基苯甲酸生成機制圖Fig 5 Formation mechanism of 2-sulfobenzoic acid

3 討論

3.1 色譜條件篩選

采用利巴韋林的堿破壞溶液，分別參照ChP2020、BP2020 中利巴韋林有關物質檢查法進行試驗。ChP2020 采用氫型陽離子交換柱，在該色譜條件下主峰出峰較快，峰形較差，與相鄰雜質峰分離度不佳，且由于該類色譜柱與有機溶劑不能耐受，無法洗脫滴眼液中抑菌劑等特殊輔料（如羥苯乙酯），連續(xù)進樣多針后對后續(xù)樣品測定造成干擾。故選擇在條件相對較優(yōu)的BP2020 基礎上對色譜柱和洗脫程序等進一步優(yōu)化。分別考察以下色譜柱（1）Waters Xbridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；（2）J＆K C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；（3）Waters Atlantis T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）。發(fā)現(xiàn)采用色譜柱（1）和（2）時，利巴韋林由于其極性強，保留時間較短，與堿破壞產(chǎn)生的雜質A 分離度不能達到4.0。采用色譜柱（3）時，利巴韋林峰保留時間約為9 min，雜質A 與主成分峰間分離度約為8.2，各雜質間分離度均良好。在此基礎上調節(jié)梯度洗脫程序，由于利巴韋林與滴眼液中特殊輔料如羥苯乙酯極性差異較大，因此本法增加乙腈梯度洗脫的程序。

3.2 不合格樣品原因分析

以擬訂限度判斷，本次抽取的96 批樣品有關物質合格率為81.2%，其中，D 企業(yè)2 批樣品均不合格，均為雜質A 超出限度，其檢出量為2.94%～2.98%；F 企業(yè)15 批樣品中14 批不合格，均為雜質A 超出限度，其檢出量為0.53%～0.73%；J 企業(yè)14 批樣品中2 批不合格，均為總雜超出限度，其檢出量為1.06%～1.08%。

不合格樣品主要由雜質A 含量超出限度（0.5%）導致，通過強制降解試驗及影響因素試驗可知，雜質A 為利巴韋林的主要降解雜質，高溫、氧化、堿性條件均會導致其大量產(chǎn)生。分析企業(yè)處方和工藝流程，如D 企業(yè)處方中含有氫氧化鈉（約3.75 μg·mL－1），生產(chǎn)工藝中采用沸水溶解原輔料，可能出現(xiàn)高溫條件下局部堿性過強，導致利巴韋林降解產(chǎn)生雜質A。因此，建議企業(yè)在生產(chǎn)工藝過程中關注原輔料的溶解溫度，避免用煮沸的方式使其溶解。同時，在使用氫氧化鈉等堿性pH 調節(jié)劑時注意其加入方式，避免局部堿性過濃造成利巴韋林的降解。

3.3 J 企業(yè)樣品生產(chǎn)時間與雜質量相關性分析

J 企業(yè)的14 批樣品測定結果顯示相對保留時間約為0.62 的雜質的檢出量為0.02%～0.34%，查閱其批號，發(fā)現(xiàn)含量為0.02%的樣品批號為200301（生產(chǎn)日期為2020年3月），含量為0.34%的樣品批號為190703（生產(chǎn)日期為2019年7月），同時期生產(chǎn)的樣品有關物質含量相當（見圖6），提示該企業(yè)雜質含量隨貯存時間延長增長趨勢較為明顯，存在質量隱患。

圖6 J 企業(yè)質隨批號變化趨勢圖Fig 6 Impurity change trend with batch number of J company

3.4 抑菌劑使用合理性分析

采用有關物質檢查方法，K 企業(yè)的17 批樣品中，2-磺基苯甲酸檢出量為利巴韋林標示量的0.32%～0.44%。按硫柳汞鈉標示量計算，則約為16%～22%，硫柳汞鈉大量降解，可能樣品中存在一定量的硫柳汞鈉分解產(chǎn)生的氯化乙基汞，氯化乙基汞為劇毒物質[11]，其中人經(jīng)口吸收，最小致死劑量為30 mg·kg－1，1 mg·L－1可致人Hela 細胞突變，同時還具有一定的生殖毒性。氯化乙基汞可經(jīng)口、呼吸道、皮膚和黏膜吸收，大劑量接觸可造成急性中毒，低劑量長期接觸可造成慢性中毒[12]，對人的神經(jīng)、心臟、皮膚等系統(tǒng)造成嚴重損害，存在較大安全隱患。因此建議硫柳汞鈉從處方中去除，且處方中不應與氯化鈉配伍使用。