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        注射用長春西汀中兩種磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的測定

        2021-10-09 08:15:58焦?jié)?/span>王濤妙苗陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院西安710065
        中南藥學(xué) 2021年9期

        焦?jié)?,王濤,妙苗(陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,西安 710065)

        注射用長春西汀是由主藥長春西汀和輔料甘露醇、山梨醇等制成的無菌粉針劑,臨床主要用于改善腦梗死后遺癥、腦出血后遺癥、腦動(dòng)脈硬化癥等誘發(fā)的各種癥狀[1]。其主要成分長春西汀是以長春胺為起始原料,經(jīng)脫水消除反應(yīng)、水解反應(yīng)和酯化反應(yīng)制得。在長春西汀中間體制備過程中使用了對(duì)甲苯磺酸作為催化劑,雖然在后續(xù)處理過程中進(jìn)行了充分的洗滌,但仍然可能殘留對(duì)甲苯磺酸,在后續(xù)的酯化反應(yīng)中會(huì)繼續(xù)反應(yīng)生成對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯。對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯為基因毒性雜質(zhì),因此需要在成品質(zhì)量中嚴(yán)格控制其含量。

        目前,對(duì)甲苯磺酸酯類的檢測方法主要有高效液相色譜法[2-7]、液質(zhì)聯(lián)用法[8-11]、氣質(zhì)聯(lián)用法[12-13]等。高效液相色譜法具有低成本、分離效率快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。注射用長春西汀中這兩種基因毒性雜質(zhì)的測定還未見有報(bào)道。本研究建立了 HPLC 法測定注射用長春西汀中對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯的含量,為該藥中潛在有害雜質(zhì)的檢測提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器

        Waters e2695 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司),XPE-105 型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

        1.2 試藥

        對(duì)甲苯磺酸甲酯(批號(hào):F1012054;純度:98.0%)、對(duì)甲苯磺酸乙酯(批號(hào):E1012037;純度:98.0%)(對(duì)照品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);注射用長春西?。?5 個(gè)廠家,共計(jì)92 批樣品,包括5 mg、10 mg、20 mg、30 mg 4 種規(guī)格);磷酸(西安試劑廠,分析純),乙腈(美國天地公司,色譜純),水為高純水。

        2 方法

        2.1 色譜條件

        色譜柱:Waters ODS2 C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸溶液(39∶61);流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:225 nm;柱溫:35℃,進(jìn)樣體積:20 μL。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯各適量,用流動(dòng)相溶解并稀釋成含對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯各約0.25 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

        2.2.2 供試品溶液制備 取供試品1 支,精密加入流動(dòng)相適量,振搖使溶解并稀釋制成每1 mL含長春西汀約為5 mg 的溶液,作為供試品溶液。

        2.2.3 輔料空白溶液制備 根據(jù)各生產(chǎn)企業(yè)提供的注射用長春西汀處方,取甘露醇、枸櫞酸、山梨醇、焦亞硫酸鈉、維生素C、酒石酸、活性炭、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、亞硫酸氫鈉、依地酸二鈉等輔料適量,配制輔料空白,稱取適量,用流動(dòng)相溶解并過濾,作為注射用長春西汀輔料空白溶液。

        2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)

        取流動(dòng)相(空白溶液)、對(duì)照品溶液、加標(biāo)供試品溶液(按“2.5”項(xiàng)下方法配制)和輔料空白溶液,照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖(見圖1)。結(jié)果顯示,對(duì)照品溶液出峰順序依次為對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯,分離度為9.2,理論塔板數(shù)分別為13 359 和13 880,空白溶液和輔料對(duì)測定無干擾。

        圖1 專屬性色譜圖Fig 1 Specific chromatogram

        2.4 線性關(guān)系考察

        精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯12.24 mg 和對(duì)甲苯磺酸乙酯9.27 mg 同置100 mL 量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋到刻度,搖勻。精密量取2.5 mL,置100 mL 量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋到刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1、1.5、2、3 和4 mL,分別置20 mL 量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋到刻度,搖勻即得線性對(duì)照品溶液。

        精密量取線性對(duì)照品溶液各20 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測試,分別獲得相應(yīng)線性方程。對(duì)甲苯磺酸甲酯:Y=6.36×104X-3.09×102,r=1.000;對(duì)甲苯磺酸乙酯:Y=6.12×104X-3.17×102,r=1.000;對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯分別在0.15~0.60 μg·mL-1,0.11~0.45 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

        2.5 回收試驗(yàn)

        考慮到各企業(yè)之間工藝和處方的差別,選擇注射用長春西汀使用輔料最多的A 公司樣品進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)。取A 公司生產(chǎn)的批號(hào)為DB190101 的樣品6 支(規(guī)格10 mg,對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯均未檢出),精密加入線性對(duì)照品溶液適量,搖勻。

        精密量取對(duì)照品溶液和上述溶液各20 μL,分別注入液相色譜儀,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,按外標(biāo)法計(jì)算回收率。對(duì)甲苯磺酸甲酯平均加樣回收率為98.9%,RSD=1.2%;對(duì)甲苯磺酸乙酯平均加樣回收率為99.5%,RSD=1.6%。結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度符合要求。

        2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

        回收率試驗(yàn)6 份加標(biāo)樣品中對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯含量均值分別為0.0059%、0.0045%,RSD均小于1.6%,表明方法的重復(fù)性符合要求。

        2.7 定量限和檢測限

        取線性對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,得對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯的定量限(S/N≈10)分別為0.037 μg·mL-1和0.045 μg·mL-1,檢測限(S/N≈3) 分別為0.015 μg·mL-1和0.023 μg·mL-1。

        2.8 精密度試驗(yàn)

        精密量取甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯對(duì)照品溶液20 μL(質(zhì)量濃度分別為0.3、0.23 μg·mL-1,如前配制)連續(xù)進(jìn)樣6 次,測得兩者峰面積的RSD分別為0.91%和2.0%。表明儀器的精密度良好。

        2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取對(duì)照品溶液于室溫放置 0、1、2、3、4、5、6 h,分別進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯峰面積有變小的趨勢,但在6 h 內(nèi)峰面積變化RSD<2.0%,建議供試品溶液在配制后6 h 內(nèi)測定。

        2.10 樣品含量測定

        取92 批注射用長春西汀樣品,分別按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜圖。按外標(biāo)法計(jì)算,結(jié)果均未檢出甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯。

        3 討論

        3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

        試驗(yàn)中先后考察了① 乙腈-0.1%磷酸溶液(39∶61),檢測波長為225 nm;② 乙腈-水(40∶60),檢測波長為220 nm;③ 乙腈-0.2 mol·L-1醋酸銨溶液(50∶50),檢測波長為260 nm 3 種體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),3 種流動(dòng)相均可滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求,但③的檢出限是①和②的10倍,且②的系統(tǒng)耐用性較差,故采用流動(dòng)相①。

        3.2 色譜柱的選擇

        試驗(yàn)中先后考查了①Waters ODS2 C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)柱、②Agilent TC-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)柱、③ACE Excel C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相條件下,3 種色譜柱均可滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求,但在使用②和③色譜柱時(shí)2 種待測物均在長春西汀主成分之后出峰,由于供試品溶液濃度較大,有一定程度的拖尾,導(dǎo)致2 種待測物的靈敏度低,達(dá)不到限度要求。采用色譜柱①,待測物在長春西汀主峰前流出,可以杜絕高濃度樣品拖尾對(duì)待測組分的干擾,降低基線噪音,提高檢測的靈敏度。

        3.3 待測物的確認(rèn)

        試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),部分廠家供試品溶液色譜圖中,在待測物甲苯磺酸甲酯保留時(shí)間附近還有其他色譜峰,為排除因保留時(shí)間漂移引起的漏檢,對(duì)上述樣品均進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證,結(jié)果表明,該色譜峰不是待測物,為長春西汀原料引入的雜質(zhì)。

        3.4 限度的確定

        根據(jù)ICH 規(guī)定,基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5 μg·d-1,長春西汀每日最大用量為30 mg,按此計(jì)算,確定本品中對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯的限度為50 ppm,即不得過0.005%。

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