陳鋒，張穎，李嘉*（1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院化學所，南寧 530022；2.廣西中藥質量標準研究重點實驗室，南寧 530022）

小葉金花草來源于中國蕨科植物野雉尾金粉蕨Onychium japonicum（Thunb.）Kze.的全草，別名金花蕨、小野雞尾、日本烏蕨等，為廣西壯族和瑤族地區(qū)民間常用中藥，其味苦，具有清熱解毒、利濕、止血的功效，用于治療風熱感冒、肺熱咳嗽、急性腸胃炎、黃疸、便血等[1]。小葉金花草在全區(qū)范圍廣泛分布，多野生于林下、河邊、山坡灌叢陰處或石山上，主要含有黃酮、萜類、香豆素、酚酸和糖苷等化學成分。藥理研究表明小葉金花草其提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛、解痙和解毒等作用[2-5]。目前未見小葉金花草在質量評價方面的相關報道，藥材中的化學成分直接關系著藥效，而中藥化學成分復雜，單個或少數指標成分很難全面反映藥材的質量。中藥指紋圖譜是研究中藥質量標準的手段之一，它能反映中藥的整體化學特征，可以在一定程度上區(qū)分中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，達到對質量的評價和控制[6-7]。主成分分析方法結合HPLC 指紋圖譜既能降低原始數據處理的量級，又能保留大部分主要信息，解決中藥質量在多元評價當中遇到的很多問題[8]。該模式能將化學成分群與藥物藥理進行分類，這有助于藥效基礎的研究和新藥的開發(fā)[9]。本研究建立了廣西13 批不同產地小葉金花草藥材的HPLC 指紋圖譜，并用對照品定性了其中部分共有峰，運用中藥色譜指紋相似度評價系統(tǒng)軟件及SPSS 統(tǒng)計軟件進行聚類分析和主成分分析，旨在為其質量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 系列四元梯度泵高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；XS205 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KS-500DE 型超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）；KDM 型調溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）。

1.2 試藥

原兒茶酸（批號：110809-201205， 純度：99.9%）、香草酸（批號：110776-201503，純度：99.8%）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；咖啡酸（批號：MUST-18032003，純度：99.48%）；菊苣酸（批號：MUST-18031720，純度：99.33%）（對照品，成都曼思特生物科技有限公司）；乙腈（美國Fisher 公司，色譜純），磷酸為分析純，水為超純水。藥材經廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授鑒定為中國蕨科植物野雉尾金粉蕨Onychium japonicum（Thunb.）Kze.的全草，具體信息見表1。

表1 小葉金花草基原信息Tab 1 Material source information of Onychium japonicum(Thunb.) Kze.

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～60 min，10%→30%A；60～105 min，30%A）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：260 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 稱取小葉金花草粉末1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入50%甲醇溶液30 mL，稱重，加熱回流1.5 h，放冷，再次稱重后補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液 分別取原兒茶酸、香草酸、咖啡酸、菊苣酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制得含上述4 種成分質量濃度分別為5.07、8.26、6.53、32.46 μg·mL－1的混合對照品溶液，過濾，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取供試品（S7）適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖。結果表明，以8號菊苣酸色譜峰為參照峰時，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.00%～0.41%和0.27%～0.61%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品（S7）溶液，分別于制備0、2、4、8、12、24 h 后，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。結果表明，以8 號菊苣酸色譜峰為參照峰時，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別為0.96%～2.3%和0.37%～1.2%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復性試驗 分別稱取同一批供試品（S7）6 份，按“2.2.1”項下方法平行制備供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。結果以8 號菊苣酸色譜峰為參照峰時，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值分別為0.24%～0.77%和1.3%～3.6%，表明該方法重復性良好。

3 結果與分析

3.1 HPLC 指紋圖譜的生成及相關分析

取13 批藥材樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。將色譜圖導入“中藥色譜指紋相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件進行分析，以S7 號色譜圖為參照圖譜，采用多點校正法進行色譜峰匹配，選擇中位數法生成對照圖譜R。13 批藥材樣品相似度在0.848～0.992，結果見表2，其中10 批藥材樣品相似度大于0.9，表明不同批次藥材樣品間差異不大。共確定了11 個共有峰，其中1、4、5、8號峰分別為原兒茶酸、香草酸、咖啡酸和菊苣酸，混合對照品溶液色譜圖見圖1，13 批藥材樣品疊加指紋圖譜見圖2。其中8 號峰峰面積較大，且分離度和對稱因子均符合要求，故設為參照峰。

表2 13 批樣品HPLC 指紋圖譜與對照圖譜的相似度Tab 2 HPLC fingerprint similarity of 13 batches samples to the reference fingerprint

圖1 混合對照品HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed control

圖2 13 批樣品的HPLC 疊加指紋圖譜Fig 2 HPLC superimposed fingerprint of 13 batches of samples

3.2 聚類分析

以11 個共有峰的相對峰面積為原始數據，導入SPSS 25.0 軟件，用平方歐式距離法測量，用組間數聯接法對13 批小葉金花草進行聚類分析，結果見圖3。13 批藥材樣品可聚類為三類：S2、S3、S8、S12、S13 聚為一類，這一類相似度結果均小于0.94；S1、S4、S6、S9、S10、S11 聚為一類；S5、S7 聚為一類。

圖3 13 批藥材樣品聚類分析樹狀圖Fig 3 Cluster analysis of 13 batches of samples

3.3 主成分分析

經SPSS 25.0 軟件對各共有峰峰面積進行標準化處理后，對13 批小葉金花草藥材指紋圖譜的11 個共有峰進行主成分分析，得出相關矩陣的特征性及其方差，部分結果見表3。前三個因子累積方差貢獻率達到84.643%，且特征根均大于1，可代表共有峰的大部分信息，故選擇該3 個主成分因子。主成分載荷矩陣見表4，它反映了各變量對主成分的貢獻程度，由表4可知，主成分1主要反映了香草酸、咖啡酸、菊苣酸和2、3、7、9、11 號峰的信息；主成分2 主要反映了原兒茶酸的信息；主成分3 主要反映了6、10 號峰的信息。通過成分得分系數矩陣計算綜合得分可以評價藥材的整體質量[10-11]，結果見表5。

表3 主成分特征值及方差Tab 3 Analysis of principal components and variance

表4 主成分載荷矩陣Tab 4 Principal components loading matrix

表5 13 批小葉金花草主成分得分、綜合得分及排名Tab 5 Factor score，comprehensive score and ranking of principal components in 13 batches of samples

4 討論

4.1 提取條件和流動相優(yōu)化

在供試品溶液的制備過程中，考察了提取方式（超聲提取、加熱回流），提取溶劑（水、甲醇、乙醇），溶劑用量（20、30、40 mL）及提取時間（0.5、1、1.5、2 h）等因素對供試品制備的影響，以HPLC 色譜圖共有峰的個數和各峰面積作為評價指標，最終確定了本研究中的制備方法。還考察了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.4%磷酸溶液體系作為流動相對化合物分離效果的影響，結果以乙腈-0.4%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，各共有峰有較好的對稱性和分離度。

4.2 分析方法評價

本文對13 批小葉金花草藥材的指紋圖譜進行分析，其中10 批藥材相似度大于0.9，說明大部分樣品具有較好的相似性。主成分分析顯示，前3 個成分因子的累積方差貢獻率達到84.643%，其中，經對照品比對出4、5、8 號共有峰分別為香草酸、咖啡酸和菊苣酸，推斷主成分1 主要反映了其中酚酸類成分的信息，其方差貢獻率達到45.397%，是影響質量的主要因素，這些酚酸類成分都是藥材發(fā)揮功能主治的基礎[12-15]，提示以菊苣酸為代表的酚酸類成分對小葉金花草藥材的質量控制有重要意義。13 批樣品可聚類為三類，小葉金花草中主要有效成分含量存在批間差異，可能與不同生長階段、不同的生長環(huán)境有關，其原因有待進一步探究[16]。